ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化
2008年7月23日
このビデオでは、ハンギングドロップ法を用いて胚様体には、マウス胚性幹細胞のin vitroでの分化に実施する方法を示しています。
幹細胞は、体内でさまざまな細胞型に成長する驚くべき可能性を秘めています。身体の一種の修復システムとして機能します。理論的には、他の細胞を補充するために無制限に分裂することができます。
幹細胞が分裂すると、新しい細胞はそれぞれ幹細胞のままになるか、より特殊な機能を持つ別のタイプの細胞になる可能性を秘めています。この有望な科学分野により、科学者はin vitroで病気を治療するための細胞ベースの治療法の可能性を調査するようになりました。胚性幹細胞の分化は、細胞が懸濁培養で凝集することが許されたときに起こります。
マウス胚、線維芽細胞フィーダー、白血病抑制因子がない場合、これらの細胞凝集体は胚体と呼ばれます。ハンギングドロップ法は、in vitroで幹細胞を胚体に分化させるための効果的な手順の1つです。こんにちは、スタンフォード大学の心臓血管医学科の左利きのSha Juanです。
今日は、ハンドドロップ法を使用して、胚性幹細胞を体内にエミネリズムするための個々の分化の手順を紹介します。通常、この方法を使用して胚性幹細胞を心筋細胞に分化させます。この手順には、以下のステップ、胚性幹細胞の単一細胞懸濁液の調製、ハンドドロップ培養物の生成、ハンドドロップ培養物の超低接着プレートへの移管、および突出コーティングプレートへの胚体へのプレーティングが含まれます。
では、始めましょう。手順の最初のステップは、胚性幹細胞の単一細胞懸濁液を調製することです。私たちは未分化の胚性幹細胞をマウスの胚性線維芽細胞上で増殖させて培養するため、細胞を切り離して線維芽細胞から分離する必要があります。
これを行うには、標準的な手順を使用して細胞をアニゼーションします。試行と治療が完了したら、マウス胚性幹細胞培地を追加してトリプシンを中和します。次に、細胞懸濁液を15ミルの円錐管に移します。
次に、チューブの底に対してピペッティングで上下に動かして、目に見える塊のない細胞の微細な懸濁が得られるまで、細胞コロニーを分割します。次に、細胞を1000RPMで5分間回転させます。スピン後、細胞はスーパーナートを吸引し、10ミルのマウスES細胞で細胞を再懸濁します。中程度。
細胞懸濁液を0.1%ゼラチンで予めコード化されたT 75フラスコに移し、5%CO2で37度で1時間インキュベートします。1時間後、線維芽細胞はプレートに付着しますが、幹細胞は培地に残ります。培地をピペットで持ち上げて幹細胞を採取します。
細胞を1000回転で5分間回転させ、培地から吸引します。次に、さらに10ミルの分化培地を加え、細胞の微細な懸濁液が現れるまで、ピペッティングを繰り返して細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。
これで、ハンギングドロップ法を使用して細胞懸濁液を培養する準備が整いました。吊り下げ培養を開始するには、分化中央値を使用して、幹細胞懸濁液を20マイクロリットルあたり500細胞の濃度に希釈します。次に、150mmの組織培養プレートカバーを反転させます。
次に、20マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートカバーの内面にピペットで移します。マルチチャンネルピペッターを使用して、10ミルのPBSをプレートに加えます。プレートカバーをすばやく反転させ、プレートにそっと置き、吊り下げ液滴を形成します。
プレートカバーが所定の位置に配置されたら、プレートをインキュベーター培養物に慎重に移します。細胞は2日間邪魔されませんでした。インキュベーションが完了したら、ハンギングドロップ培養液を超低付着プレートに移す作業を進めます。
2日後、慎重にプレートカバーを裏返し、次に180マイクロリットルの新鮮な分化培地を吸引し、96ウェル超低アタッチメントプレートに数滴を入れます。次に、ピペットで液滴を拾い上げ、1つずつ96ウェルプレートに移します。プレートをインキュベーターに3日間邪魔されずに置きます。
胚体はボール状に成長し続けます。インキュベーションが完了すると、胚体をプレート化する準備が整います。胚体が分化し続けるのを助けるために。
48ウェルゼラチンコーティングプレートに移します。これを行うには、まずプレートの各ウェルを300マイクロリットルの0.1%ゼラチンでコーティングします。ゼラチンを加えた後、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、48ウェルプレートからゼラチンを吸引します。次に、それぞれに300マイクロリットルの分化培地を追加します。さて、今、胚体を96ウェルから48ウェルゼラチンコーティングプレートに1つずつ移します。
通常、細胞を維持するために、翌日に培地を交換し、その後は一日おきに培地を交換します。この方法を使用して、胚性幹細胞を分化するためのより良いプロトコルを探します。心筋細胞では、ハンギングドロップ培養を使用してマウス胚性幹細胞のin vitro分化を行う方法を示しました。
この方法は、吊り下げ液滴の丸い底が胚性幹細胞の凝集を可能にし、したがってエンブリー体の形成に適した環境を提供するため、効果的です。この手順を実行するときは、最初の細胞懸濁液中の細胞の数を変えることで、ぶら下がっている滴に凝集する胚性幹細胞の数を制御できることを覚えておくことが重要です。それです。
ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験がうまくいくことを願っています。
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概要
このビデオは、ハンギングドロップ法を用いたマウス胚胎幹細胞のインビトロでの胚体様体の分化を示しています。幹細胞は様々な細胞タイプに発達する可能性があり、体の修復システムとして機能します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 細胞分化
- インビトロ培養技術
背景
- 幹細胞は理論上、無制限に分裂することができます。
- 各新しい細胞は幹細胞のままでいるか、特殊化した細胞に変化することができます。
- この科学分野は細胞ベースの治療法への可能性を導いています。
- 胚胎幹細胞の分化は懸濁培養で行われます。
研究の目的
- 胚胎幹細胞の分化を実証すること。
- 細胞集合のためのハンギングドロップ法を紹介すること。
- 潜在的な治療応用への洞察を提供すること。
使用した方法
- マウス胚胎幹細胞のインビトロ分化。
- 細胞集合のためのハンギングドロップ法。
- 懸濁培養技術。
- 胚体様体の形成の観察。
主要な結果
- 幹細胞からの胚体様体の成功的な形成。
- ハンギングドロップ法の有効性の実証。
- 幹細胞の分化プロセスへの洞察。
- 細胞ベースの治療への潜在的な影響。
結論
- ハンギングドロップ法は幹細胞の分化に効果的です。
- 胚体様体はマウス胚胎幹細胞からインビトロで形成することができます。
- この技術は再生医療の研究を進展させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Controlled embryoid body formation enables reproducible in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine research. The hanging drop method provides a scalable, standardized approach to generate homogeneous multicellular aggregates, reducing variability in downstream phenotypic screening and assay development. This technique enhances predictive confidence by allowing precise cell number control, facilitating consistent embryoid body generation for therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell differentiation pathways and functional target validation through controlled embryoid body formation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing a reproducible system to assess lineage commitment and early differentiation markers.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by allowing standardized evaluation of differentiation efficiency across genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated embryoid body systems for downstream compound screening and phenotypic assessment.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled cell aggregation in hanging drops.
- Scalability: Enables platform reuse and consistent compound evaluation across multiple wells and plates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by generating embryoid bodies that model early developmental processes pertinent to regenerative therapies.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via standardized embryoid body production.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative assessment of differentiation kinetics and homogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
The hanging drop method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation through lead identification and preclinical validation, enabling standardized embryoid body generation for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled aggregation of mouse embryonic stem cells into embryoid bodies.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through uniform embryoid body formation, facilitating reliable compound screening outcomes.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as embryoid body size, number, and morphology to compare differentiation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating disease-relevant embryoid bodies for mechanistic de-risking and biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects requiring standardized embryoid body production for differentiation assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in differentiation outcomes, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of embryoid body formation across laboratories and experiments.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in regenerative medicine pipelines.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on consistent embryoid body quality and differentiation efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, single-cell suspension preparation, and embryoid body handling.
- Depends on access to low-attachment plates, gelatin-coated surfaces, and standardized differentiation media.
- Necessitates cross-team standardization of cell concentration, drop volume, and incubation timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring embryoid bodies to different culture surfaces for downstream differentiation.
- Limited by the need for manual pipetting precision and careful handling to avoid embryoid body disruption during transfer steps.
