Name: ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶハンギングドロップ法によるマウス胚性幹細胞のin vitro分化。エンブリオイドボディ形成を通じて幹細胞の分化過程を観察し、再生医療研究への応用可能性を探る実験手法です。

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<ol><li>前に37℃、5％CO 2組織培養インキュベーターで一晩一日に0.1％ゼラチン溶液とインキュベートプレートを使用してT75フラスコをゼラチン状にする。 </li><li> 、インキュベートからMESの細胞を取り出し、培地を吸引除去し、PBSでES細胞培養をすすぎ、皿のコート底を（2 ml/100mmプレート）に0.05％トリプシン溶液を加える。 </li><li>細胞がプレートを脱却するまで、37℃で約1分間インキュベートする。 </li><li>静かに、接続されてパスツールピペットを持つES細胞を分散させるために4〜6回（ピペットの上下）トリプシン処理細胞をひいて粉にする。温めておいた（37℃）MESの培地を含む15 mlのコニカル遠心チューブに分散したES細胞を移す。 </li><li>遠心分離により細胞を収集する。 、上清を吸引するMESの培地10mlを追加し、単一の細胞懸濁液を形成するために上下にピペッティング。 </li><li> 37℃で0.1％のゼラチンおよびインキュベーションをプレコートT75フラスコに細胞懸濁液を移す℃で1時間5％CO 2で * 1時間後、線維芽細胞はプレートに取り付けられているが、幹細胞は、培地中に残ります。幹細胞を収集するための培地をピペッティング。 </li><li> 5分間1000rpmで細胞をスピンし、MESの培地をオフに吸引除去する。その後、MESの分化培地の別の10 mlを追加したり、セルの微細な懸濁液があるように表示されるまで、反復的なピペッティングにより細胞を再懸濁します。 </li><li>滅菌流域における20ul（20ul/drop）あたり400〜500細胞の濃度に幹細胞懸濁液を希釈するために血球計算板の使用の分化培地で細胞をカウント。 </li><li>蓋を持ち上げ、慎重にそれを反転し、10mlのPBSを含む皿の上に置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、組織培養皿の蓋の上から転身内面に20ul滴の行を作る。 </li><li>慎重に2日間インキュベーターで皿を置きます。 2日後、慎重に、プレートカバーをめくり180 ulの新鮮な分化培地を吸引し、96ウェル超低アタッチメントプレートのウェルに数滴を入れて。その後ピペットと転送滴、一人ずつ、96ウェルプレートへとピックアップドロップを。 3日間静インキュベーターにプレートを置きます。 </li><li>コー​​ト0.1％ゼラチンの300ulと48ウェル組織培養プレートの各ウェルに。 EBSを転送する前にゼラチンを添加した後、℃、一日前に37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、48ウェルプレートからゼラチンを吸引除去する。次に、各ウェルに分化培地の300 ulを加える。 96ウェルプレートから48ウェルゼラチンコートプレート一つずつにEBSを転送する。翌日培地を変更してから細胞を維持するために一日おきに培地を変更してください。 </li><li>自発cardiaomyocyte収縮は7日以内に明らかにする必要があります。 </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

滴の液量は、表面張力によって蓋の上にぶら下がって降下を維持するために以下50ULに限定されており、それがドロップを干すための培地を変更することは不可能だ：ハンギングドロップ法の短所は次のとおりです。顕微鏡で直接滴でEBSを形成するの観察は、栽培中にも非常に困難である。さらにもっと、ハンギングドロップ法は、次の2つの手順で構成され、従って、ハンギングドロップ法のステップのシリーズは、面倒かもしれません。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>試薬</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン / ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>試薬</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子(LIF)</td><td>試薬</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル超低接着プレート</td><td>器具</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（mes）細胞のin vitroにおける分化

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

幹細胞は多くの異なる細胞型に開発するために驚くべき可能性を秘めている。幹細胞が分裂するとき、それぞれの新しい細胞がどちらの幹細胞を維持またはより専門的な機能を持つ細胞の別の型になる可能性を秘めている、科学のこの有望な、病気を治療するために、細胞ベースの治療の可能性を調査する科学者をリードしています。ときにantidif​​ferentiation因子のない懸濁液中の文化、胚性幹細胞は、自発的に分化し、三次元多細胞集合体を形成する。これらの細胞凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれています。ドロップの文化を吊るすことは広く使用されているEBの形成誘導法である。ハンギングドロップの丸みを帯びた底は、EBSを形成するためのMESの細胞に良い環境を提供することができるES細胞の凝集することができます。ハンギングドロップでaggregatied ES細胞の数は、ペトリ皿の蓋からのドロップとしてハングアップしているように初期の細胞懸濁液中の細胞の数を変えることによって制御できます。このメソッドを使用して我々は、再現性ES細胞の所定の数から均質なEBSを形成することができます。

このビデオでは、ハンギングドロップ法を用いて胚様体には、マウス胚性幹細胞のin vitroでの分化に実施する方法を示しています。

ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化

幹細胞は、多くの異なる細胞型へと分化するという優れた能力を有している。幹細胞が分裂すると、新たに生成された各細胞は、以下のいずれかの可能性を持つ。

幹細胞は、体内の多種多様な細胞へと分化するという驚異的な能力を持っており、一種の身体修復システムとして機能します。理論的には、無限に分裂して他の細胞を補充することが可能です。幹細胞が分裂すると、それぞれの新しい細胞は、幹細胞のままで留まるか、あるいはより特化した機能を持つ別の種類の細胞になるかのいずれかの可能性を持ちます。この有望な科学分野により、研究者は疾患を治療するための細胞ベースの治療法のin vitroでの可能性を調査しています。胚性幹細胞の分化は、細胞を浮遊培養中で凝集させることで起こります。マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞および白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor）が存在しない環境下で、これらの細胞凝集塊は胚様体と呼ばれます。吊り滴法（hanging drop method）は、幹細胞をin vitroで胚様体へと分化させるための有効な手法の一つです。こんにちは。スタンフォード大学心血管医学部門のSha Juanです。本日は、ハンドドロップ法を用いた胚性幹細胞から胚体への個別の分化誘導手順をご紹介します。通常、この方法は胚性幹細胞を心筋細胞に分化させるために使用されます。この手順には、胚性幹細胞の単一細胞懸濁液の調製、ハンドドロップ培養の作製、ハンドドロップ培養から超低接着プレートへの移行、および胚体のjutコートプレートへの播種というステップが含まれます。それでは、始めていきましょう。本手順の最初のステップは、胚性幹細胞の単一細胞懸濁液を調製することです。未分化の胚性幹細胞をマウス胚性線維芽細胞上で培養しているため、細胞を剥離させ、線維芽細胞から分離させる必要があります。この操作を行うため、標準的な手順に従って細胞をトリプシン処理します。トリプシン処理が完了したら、マウス胚性幹細胞培地を加えてトリプシンを中和させます。次に、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。次に、チューブの底でピペッティングを繰り返し、目に見える塊がない均一な細胞懸濁液になるまで細胞コロニーを分散させます。その後、細胞を1,000 RPMで5分間遠心分離します。遠心後、上清を吸引し、10 mLのマウスES細胞培地で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を0.1% gelatinでコーティングしたT 75フラスコに移し、37°C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。1時間後、線維芽細胞はプレートに接着しますが、幹細胞は培地中に留まります。ピペットで培地を回収し、幹細胞を集めます。細胞を1,000 RPMで5分間遠心分離し、培地を吸引して除去します。次に、分化培地をさらに10 mL加え、細胞が均一な懸濁液になるまで繰り返しピペッティングして再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。これで、吊下滴法（ハンギングドロップ法）を用いて細胞懸濁液を培養する準備が整いました。吊下滴培養を開始するには、分化培地を使用して幹細胞懸濁液を20 µLあたり500個の細胞濃度に希釈します。次に、150 mm組織培養プレートの蓋を裏返します。次に、細胞懸濁液 20 µL をプレートカバーの内表面にピペッティングします。マルチチャンネルピペッターを使用して、プレート上に 10 mL の PBS を加えます。素早くプレートカバーを反転させ、プレートの上に静かに置いて、吊垂滴（ハンギングドロップ）を形成させます。プレートカバーを装着したら、慎重にプレートをインキュベーターに移して培養します。2日間、細胞を静置してください。インキュベーションが完了後、ハンギングドロップ培養物を超低接着プレートに転移させます。2日後、プレートカバーを慎重に裏返し、新鮮な分化培地を180 µL吸引し、96ウェル超低接着プレートに数滴ずつ滴下します。次に、ピペットでそれらの液滴を吸い上げ、96ウェルプレートへ1つずつ移します。プレートをインキュベーターに入れ、3日間静置します。胚体は引き続き球状に成長します。インキュベーションが完了すると、胚体をプレートに播種する準備が整います。これは、胚体の分化をさらに促進させるためです。これらをゼラチンコート済みの48ウェルプレートに移します。まず、プレートの各ウェルに0.1%ゼラチンを300 µLずつコーティングします。ゼラチンを添加した後、プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、48ウェルプレートからゼラチンを吸引して除去します。その後、各ウェルに分化培地を300 µLずつ加えます。次に、胚体を96ウェルプレートからゼラチンコートした48ウェルプレートへ1つずつ移します。通常、細胞を維持するために、翌日、その後は1日おきに培地を交換します。私たちは、胚性幹細胞を分化させるためのより優れたプロトコルを探索するためにこの手法を用いています。心筋細胞に関しては、ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹細胞のin vitro分化誘導の手順を説明しました。この手法が有効なのは、ハンギングドロップの底が丸いことで胚性幹細胞の凝集が促され、胚様体（Embry bodies）の形成に適した環境が提供されるためです。この手順を行う際は、初期細胞懸濁液中の細胞数を変えることで、ハンギングドロップ内に凝集させる胚性幹細胞の数を制御できる点に留意することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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