Name: 磁気共鳴イメージングのためのヒト胚性幹細胞のin vitroでラベリングの (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学ぶ ヒト胚性幹細胞のマンガン塩化物ラベリング法とMRIによる生存細胞追跡技術。電位依存性カルシウムチャネルを介した取り込みにより、鉄酸化物に代わる有効なコントラスト剤として機能し、再生医療研究に貢献します。

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ヒト胚性幹細胞のマンガン標識<ol><li>フィーダーフリーで5分間の条件で培養されたヒト胚性の茎をトリプシン処理。培地を加えることによってトリプシンを中和する。 </li><li> 20℃で5分間800rpmで遠心分離によって細胞をスピンダウン摂氏。細胞ペレットを再懸濁させた後、トリパンブルー染色により細胞数をカウント。得られた細胞の数に基づいて、コニカルチューブに3万個の細胞の4つのアリコートにセルを分割します。遠心分離によって再び細胞をペレット化。 </li><li>単にマンガンラベリングを開始する前に、0.1mmの塩化マンガン溶液を作るために0.9％塩化ナトリウム溶液で新鮮な塩化マンガンを溶解する。 </li><li>カルシウムチャネル活性を観察するために、4つのサンプルを調製した。最初のサンプルは、単独で0.9％塩化ナトリウムでインキュベートした細胞を含む私たちのコントロールです。 2番目のサンプルは、0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。サンプル3と4は、Ca 2 +チャネルアゴニストの5μMのいずれかと0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞、（S )-(-)-ベイK8644、またはCa 2 +チャネル拮抗薬、ベラパミルの250μMが含まれています。 37 4つのサンプルをインキュベート℃で30分間、5％CO 2で摂氏。 </li><li> 30分後、20℃摂氏で5分間800rpmで細胞をスピンダウン。その後、上清を吸引し、PBSで2回標識された細胞を洗う。洗浄後、PCRチューブに200μLのPBSと転送で各ペレットを再懸濁する。これらのペレットは、通常は白です。 </li></ol>ヒト胚性幹細胞の鉄ラベリング<ol><li> 1 mg / mLの原液を得るために蒸留水で臨床グレードの硫酸プロタミンを混ぜる。 </li><li>ヒト胚性幹細胞の培養培地を含むチューブに、12μg/ mLの硫酸プロタミンを加えて100μg/ mlの時ferumoxidesを追加します。 5分間激しくソリューションを混ぜる。 </li><li> ferumoxides 50μg/ mLのとラベルの細胞にプロタミン硫酸塩の6μg/ mLの最終濃度を達成するために細胞培養培地を等量に混合溶液を追加。 12時間このソリューションで細胞をインキュベートする。 </li><li>細胞外ferumoxides -硫酸プロタミン複合体を溶解する10U/mlヘパリンを含む最後の洗浄を、PBSで細胞を2回洗浄する。洗浄後、単一の細胞懸濁液を得るために細胞をトリプシン処理。 </li><li>サンプルの必要数に細胞やアリコートを数える。洗浄後、PCRチューブに200μLのPBSと転送で各ペレットを再懸濁する。これらのペレットは色の濃いオレンジブラウンにする必要があります。 </li></ol>携帯磁気共鳴イメージングの実行<ol><li>細胞ペレットを含むチューブを安定させるために、また、スキャン中に周囲の空気からのアーチファクトを避けるために、ファントムを行います。そのためには、蒸留水に寒天0.8％と硫酸銅の1％を混ぜると5-7分のために電子レンジで沸騰することをもたらす。ゲルを達成するためにスキャンの前に少なくとも1時間この混合物を冷却する。 </li><li>標識細胞ペレットを含むチューブは、スキャン用ファントムに配置されます。試験管内の細胞MRIの臨床膝のコイルを使用してのSigna半二重（HDx）3T MRI（GEメディカルシステムズ）で行われます。 </li><li>スピンエコーシーケンスを使用して3つのサンプルのそれぞれに対してマンガン標識された細胞をスキャンする：TRを、繰り返し時間= 800ミリ秒。 TE、エコーの時間=最小、FOV、視野= 12 × 12センチメートル、マトリクス= 256 × 256、NEX 1。 </li><li>グラディエントエコーシーケンスを使用して鉄標識された細胞をスキャンします。我々は、このイメージングのための次のパラメータを使用します。TR = 100ミリ秒、TE = 10ミリ秒、FA、フリップ角= 30 °、FOV = 12 × 12センチメートル、マトリクス= 256 × 256、NEX 1。 </li></ol> MRI結果の解析<ol><li>マンガン標識細胞の4種類のサンプルからMRIスキャンの画像を分析する。 <ul><li>サンプル＃1は、単独で0.9％塩化ナトリウムでインキュベートした細胞を含む私たちのコントロールです。 </li><li>サンプル＃2は、0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。 </li><li>サンプル＃3は、Ca 2 +チャネルアゴニストの5μM、（S )-(-)-ベイK8644と0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。 </li><li>サンプル＃4は、Ca 2 +チャネル拮抗薬、ベラパミルの250μMと0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。 </li></ul></li><li>予想通り、マンガン標識された細胞からの信号強度の違いが表示されています。マンガンと純粋に標識された細胞と比較して、信号強度は明らかにカルシウムチャネルのアゴニストの存在下で増加し、カルシウムチャンネル拮抗薬の存在下で減少する。信号強度は、マンガン標識された細胞のために増加している領域は、イメージJを（NIH、ベセスダ、MD、米国）を用いて測定されています。同ソフトウェアは、鉄標識された細胞から濃いオフ共鳴信号の領域を分析するために使用されます。鉄で標識された細胞からの暗信号の大きさは、細胞または細胞に含まれる鉄の粒子の数の数によって異なります。このケースで、100万セルは300万セルからの信号に比べて暗い信号の小さな領域を示しています。 </li></ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

これらの結果は、マンガンはまた、細胞の生存率を示すことができる電位依存性カルシウムチャネル、およびマンガンはMRI造影剤として使用することができる、を経由して入力していないことを示している。したがって、我々はマンガン誘導MRIは心筋にヒト胚性幹細胞の移植後の細胞生存率を監視するために有用であることを示唆している。

<table><tbody><tr><td>塩化マンガン四水和物</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(-)-Bay K8644 </td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>(+)-ベラパミル塩酸塩、滴定純度 99.0% 以上</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム 0.85-0.90% W/V</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V. </td><td>試薬</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>フェルムキシド注射液 11.2mg iron/mL</td></tr><tr><td>プロタミン硫酸塩</td><td>試薬</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR (ES細胞用血清代替物)</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプト&amp;#8211;エタノール 98+%</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200mM 100x</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 10,000 units/ml</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 100x 溶液</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Signa HDx 3T MRI</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>臨床用膝コイル</td><td>装置</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

磁気共鳴イメージングのためのヒト胚性幹細胞のin vitroでラベリングの

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）負傷した心筋を復元する能力を実証している。磁気共鳴イメージング（MRI）は、負傷した心筋の回復を評価するための主な画像診断法の一つとして浮上している。さらに、このような酸化鉄ナノ粒子などの生体外の標識剤は、追跡するために採用し、移植された幹細胞をローカライズされています。しかし、この方法は、移植細胞の生存率に関する基本的な細胞生物学のプロパティを監視しません。それは、塩化マンガン（MnCl 2を ） は電位依存性カルシウム（Ca 2 +）細胞は生物学的に活性であるチャネルを介して細胞に入ると、T 1短縮の効果を生成する細胞内で蓄積することが知られている。したがって、我々はマンガン誘導MRIは心筋へのhESCの移植後の細胞生存率を監視するために有用であることを示唆している。 このビデオでは、我々は、MnCl 2を 、どのようにそれらの細胞は明らかにin vitroでMRIを用いて見ることができるとヒトES細胞をラベルする方法が表示されます。それと同時に、 カルシウムの生物活性は、+ -チャネル併用信号の変化を評価するためのCa 2 +チャネルのアゴニストおよびアンタゴニストの両方を利用して変調されます。

このビデオでは、我々は、塩化マンガンを持つヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）（MnClラベルの作成方法を示しています<sub&gt; 2</sub&gt;）細胞が生物学的に活性であるときに電位依存性カルシウムチャネルを介して細胞に侵入することができます。さらに、我々は、MnClの使用方法を示して<sub&gt; 2</sub&gt;携帯MRI造影剤として、ヒトES細胞のin vitroでの生存率を決定する。

ヒト胚性幹細胞（hESC）は、損傷した心筋を回復させる能力を持つことが示されている。磁気共鳴画像法（MRI）は、その一つとして……

磁気共鳴画像法（MRI）は、移植された幹細胞の局在化および再生メカニズムのより深い理解のための主要な画像診断法として台頭しています。これらのMRI研究では、通常、造影剤として酸化鉄ナノ粒子が使用されます。しかし、鉄粒子は幹細胞の死後も組織内に留まることがあり、またマクロファージに貪食される可能性があるため、生存している移植細胞を追跡する上で最適ではない条件となる場合があります。このビデオでは、塩化マンガンが効果的な代替手段であることを実証します。塩化マンガンを用いた造影剤標識は、酸化鉄標識に比べていくつかの利点があります。例えば、酸化鉄粒子ではネガティブシグナルが得られるのに対し、マンガンではポジティブシグナルが得られます。さらに、マンガンイオンは電位依存性カルシウムチャネルを介して細胞内に進入することが知られています。したがって、MRIにおいてマンガンが検出されることは、生物学的に活性な生存細胞が存在することを示しています。こんにちは。スタンフォード大学心血管医学部門のPhilip Yang研究室のUni motherです。本日は、磁気共鳴画像法（MRI）を用いてヒト胚性幹細胞をマンガンで標識する方法について解説します。この手順には、造影剤を用いたヒト胚性幹細胞の標識、in vitroでの細胞MRIの実施、およびMRI結果の解析というステップが含まれます。それでは、始めていきましょう。ラベル化手順の最初のステップは、胎児血清不含条件下で培養したヒト胚性幹細胞を準備することです。まず、細胞をトリプシンで5分間処理し、その後、培地を加えてトリプシンを中和させます。次に、20 °Cで5分間、800 RRP Mで遠心分離し、細胞を回収します。PBSで細胞ペレットを再懸濁させた後、トリパンブルー染色により細胞数をカウントします。得られた細胞数に基づき、細胞を必要な数の分注量に分けてコニカルチューブに入れます。今回は、300万個ずつの4つのチューブに細胞を分けています。マンガン標識を開始する直前に、遠心分離により細胞を再度ペレット化します。新鮮な塩化マンガンを0.9%塩化ナトリウムに溶解し、0.1 mMの塩化マンガン溶液を調製します。カルシウムチャネル活性を観察するため、サンプルを準備しました。1つ目のサンプルは対照群であり、0.9% 塩化ナトリウムのみでインキュベートした細胞を含んでいます。2つ目のサンプルには、0.1 millimolar 塩化マンガンでインキュベートした細胞が含まれています。サンプル3および4には、0.1 millimolar 塩化マンガンに加えて、5 micromolar のカルシウムチャネルアゴニスト AK 8 6 44 または 250 micromolar のカルシウムチャネルアンタゴニストのいずれかでインキュベートした細胞が含まれています。次に、4つのサンプルを37 °C、5% CO2条件下で30分間インキュベートします。30分後、細胞を20 °Cで800 RPMにて5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、標識した細胞をPBSで2回洗浄します。洗浄後、各ペレットを200 µLのPBSで懸濁し、PCRチューブに移します。これらのペレットは通常、白色です。これで、比較目的のためのマンガン標識細胞の調製が完了しました。次に、鉄標識を開始するため、より伝統的な鉄標識法を用いて細胞を調製します。臨床グレードの硫酸プロタミンを蒸留水で希釈し、1 mg/mLのストック溶液を調製します。次に、ヒト胚性幹細胞培養液を含むチューブに、100 µg/mLの酸化フィルムと12 µg/mLの硫酸プロタミンを添加します。その後、溶液を5分間混合します。溶液を混合した後、混合液と同量の細胞培養培地を用いて細胞に添加し、酸化物の最終濃度を50 µg/mL、プロタミン硫酸塩の最終濃度を6 µg/mLにします。細胞を12時間インキュベートし、その後、細胞外の酸化物-プロタミン硫酸塩複合体を溶解させるため、最後に10 U/mLのヘパリンを含むPBSを用いて細胞を2回洗浄します。洗浄後、細胞をトリプシン処理して単一細胞懸濁液とし、細胞数をカウントしてから、必要なサンプル数に分注します。本ケースでは、100万個の細胞を含むサンプル1つと、300万個の細胞を含むサンプルもう1つを調製します。次に、細胞のペレットは、オレンジ色または茶色に見えるはずです。最後に、各ペレットを200 µLのPBSで再懸濁し、PCRチューブに移します。細胞の標識が完了しました。続いて、細胞のMRイメージングを行います。イメージングを開始するにあたり、まずファントムを作成します。これは、細胞ペレットを含むチューブを固定し、スキャン中の周囲の空気によるアーチファクトを防止するためです。そのために、1%の硫酸銅と0.8%のアガーを蒸留水に混ぜ合わせ、電子レンジで5〜7分間加熱して沸騰させます。その後、この混合液を少なくとも1時間冷却し、ゲル化させます。次に、ラベル付けされた細胞ペレットを含むチューブを、スキャンのためにファントム内に配置します。in vitro 細胞 MRI は、臨床用膝コイルを用いた 3.0 T スキャナーで実施します。GE Medical Systems 社製の Signa を使用し、スピンエコー法を用いて 4 つのサンプルそれぞれのマンガンラベル化細胞をスキャンします。シーケンスのパラメータは、以前に行われたラベル化細胞の T マッピングの検討結果に基づいて設定しています。エコー時間を最小限にし、繰り返し時間を800 millisecond、視野を12 by 12 centimeter、マトリックスを256 by 256に設定して使用します。次に、グラジエントエコー法を用いて、鉄標識した細胞をスキャンします。この撮像では、以下のパラメータを使用します。エコー時間は10 milliseconds、繰り返し時間は100 millisecondsです。フリップ角は30 degrees、視野（FOV）は12 by 12 centimeter、マトリックスサイズは256 by 256、ネクサスは1です。それでは、イメージングはすべて完了しました。結果を確認しましょう。ここでは、マンガンでラベル付けされた4つの異なる細胞サンプルのMRIスキャン結果を示します。サンプル1はコントロールであり、0.9%塩化ナトリウムのみでインキュベートした細胞が含まれています。サンプル2には、0.1 mM塩化マンガンでインキュベートした細胞が含まれています。サンプル3には、0.1 mM塩化マンガンと5 µMのカルシウムチャネルアゴニストであるVK-8644でインキュベートした細胞が含まれています。サンプル4には、0.1 mMの塩化マンガンおよび250 µMのカルシウムチャネル拮抗薬であるverapamilと共にインキュベートした細胞が含まれています。マンガンのみでラベル化した細胞と比較して、信号強度はカルシウムチャネル作動薬の存在下で増加し、カルシウムチャネル拮抗薬の存在下で減少します。マンガンでラベル化された細胞の信号増加領域をImage Jを用いて測定します。この結果は、マンガンが電位依存性カルシウムチャネルを介して流入することを示しています。それでは、この結果を鉄で標識した細胞の結果と比較しましょう。マンガン標識細胞からの明るい陽性信号と、鉄標識細胞からの暗い陰性信号の違いに注目してください。以上で、in vitroの細胞磁気共鳴イメージングに向けたヒト胚性幹細胞のマンガン標識の手順について説明しました。この手順は、わずか30分間のインキュベーションでマンガンを容易に細胞内に導入できるため、幹細胞を追跡するための効果的な手法となります。また、マンガンで標識された細胞は陽性信号を伴う鮮明な画像を提供します。さらに、カルシウムチャネル作動薬および拮抗薬を用いた結果から明らかなように、マンガンは電位依存性カルシウムチャネルを介して細胞内に進入するため、生存細胞にのみ導入されます。したがって、ヒト胚性幹細胞のマンガン標識は、虚血損傷部位に移植したヒト胚性幹細胞の効果を追跡するための、精密なin vivo細胞MRIにおいて大きな可能性を秘めていると考えられます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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