マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Sea Eleganceは、その細胞系譜に関する知識と、全ゲノムの配列決定と分析から得られる豊富な情報の両方により、非常に有用なモデル生物です。このビデオでは、シーエレガンスにプラスミドをマイクロインジェクシングするプロセスと、蛍光顕微鏡法を使用してトランスジェニック子孫を透明で多細胞動物として選択する方法を示します。シーエレガンスは、蛍光標識タンパク質をin vivoで発現するトランスジーンを視覚化するのに理想的です。こんにちは、私の名前はローラ・バーコウィッツで、ここアラバマ大学の生物科学部のコールドウェル研究室の研究員です。

そして、私は同じくアラバマ大学のカルウェル研究室のアダム・ナイトです。今日は、トランスジェニックシーエレガンスを生成するためのプラスミンマイクロインジェクションの準備と実行方法、そしてトランスジェニックシールエレガンスラインの選択と維持方法をお見せします。それでは始めましょう。

マイクロインジェクションを始める前に、いくつかの準備ステップがありますので、これからお見せします。まず、注入するプラスミドDNAを調製すると、目的の遺伝子の組織特異的発現をコードするプラスミドと、選択可能な形質転換マーカーを提供するプラスミドの2つが必要です。プラスミドを1マイクロリットルあたり50ナノグラムの1対1の比率で混合します。

次に、注射用のワームを固定するために使用されるオーガーパッドを準備します。オーガーパッドを作るには、まずベンチトップに22×50mmのカバーグラスを数枚並べます。牧草地のピペットを使用して、溶かした2%アグロスを1つのカバーグラスに一滴垂らし、すぐに2番目のカバーグラスを最初のカバーグラスに対して90度の角度でドロップの上に置きます。

エアロが数秒間固まるのを待ってから、トップカバーガラスを取り外します。エアロの平らなディスクの直径は15〜20ミリメートルである必要があります。ペットのように、パッドを数時間または一晩完全に風乾させます。

乾いたら、パッドをカバーガラスの箱に室温で保管します。次に、DNA溶液用のニードルローダーを準備します。これを行うには、100マイクロリットルの毛細管を取り、直火の真ん中で加熱し、急速にその約2倍の長さに引っ張ります。

キャピラリーチューブが冷えたら、2つの半分をはめ込みます。注射用のニードルローダーを10〜20台備蓄します。マイクロ遠心分離機のチューブに立てて保管できます。

ブラック、気をつけて。ニードルローダーのポイントは非常にシャープです。次に、マイクロインジェクション針を作ります。

これらの針は、内部にガラスフィラメントを含む特別な毛細管から作られています。このフィラメントは、DNA溶液の芯として機能します。針を作るために、私たちは24.8の熱設定でニキPPエイト30ポーラーを使用し、一度にいくつかの針を引っ張って保管します。

モデリング粘土のストリップに複数の針を取り付けることができます。カバーガラスの小さな破片を使用して、引っ張った針の先端を壊します。この破片は、18 x 18 mm のカバーガラスを Kim ワイプで包み、数個に割れるまで静かに圧力をかけます。

サイズが約 3 x 4 mm のシャードを使用します。DNAと針を調製するだけでなく、50〜100本程度をきちんと病期分類して調製します。各発現ベクターコンストラクトに対して2つの野生型ワームを注入します。

これで、マイクロインジェクション顕微鏡をセットアップする準備が整いました。顕微鏡のセットアップを開始するには、マイクロインジェクションニードルアームとホルダーに接続されているヘリウムタンクのメインバルブを開きます。レギュレーターを閉じて、ガスがラインに入るようにします。

圧力を35PSIにすると、フットペダルを使用してガスを解放できます。次に、ニードルローダーを標準的なマウスピペッターチューブに挿入し、約1マイクロリットルのプラスミド混合物を少量滴下します。次に、抵抗が感じられるまで、ローダーをマイクロインジェクション針にそっと挿入します。

DNA溶液を静かに吹き飛ばして排出し、ローダーを取り外します。DNAがロードされたら、針をマイクロインジェクションアームに挿入し、小さな内部ゴム製ガスケット内に針を配置し、マニピュレーターのアームに固定します。次に、オーガーパッドの一方の端にカバーガラスの針折れ破片を置きます。

シャードとオーガーパッドの全面をハローカーボンオイルで覆います。次に、オーガーパッドを倒立顕微鏡のステージに置きます。オーガーパッドが所定の位置に配置されたら、Forex対物レンズと明視野照明を使用して、針を視野の中央に配置しますが、まだオイルに下げないでください。

次に、カバーガラスの破片の内側の端を中央に配置し、それに焦点を合わせます。針をオイルに下げ、カバーガラスの破片と同じ焦点面に持ってきます。対物レンズを40倍に切り替えて倍率を上げ、シャードの端に再度焦点を合わせ、必要に応じて針の先端を再配置します。

次に、注射針の先端を壊します。針をカバーガラスの破片の端にそっと押し付けながら、同時にフットペダルで短いパルスのガスを印加します。針は十分に折れて開きます。

液体の小さな液滴が針の端から逃げると、大きすぎて余分な液体の流れが流れ、開口部は動物を殺すため望ましくありません。針の準備ができたら、マイクロインジェクションを開始します。次に、針を上に上げてオーガーパッドをステージから取り外します。

ただし、X軸またはY軸の位置は変更しないでください。針の下からステージをスライドさせて出します。オーガーパッドを取り外し、解剖顕微鏡に置きます。

オイルの表面の下のパッドに単語を移します。ワームがうごめく場合は、オーガーパッドに接触するまで優しく撫でると、湿ったワームがドライアグロに付着するはずです。オーガーパッドをすばやくステージに戻し、ワームを視野の中央に配置します。

次に、針をワームと同じ焦点面に下げます。反転スコープのフィルターをホフマン照明に切り替えます。このコントラストフィルターにより、ワームの形態学的詳細を可視化できます。

40 倍の対物レンズを使用して、胚芽核のハニカムパターンの下にある線虫の生殖腺の粒子の粗い感覚中心に焦点を合わせます。針に面したワームの側に配置されている生殖腺を選択します。いい。先端にもピントが合うまで針の位置を調整します。

針を生殖腺の中心にそっと挿入し、ガス圧の短いパルスを適用して、DNAの液滴を生殖腺アームに排出します。遠位のゴード全体に広がる液体の波を、多くの練習とスキルで観察する必要があります。毎回ゴードセンターを打つことができます。

ワームを注入しながら迅速に作業することが重要であることに注意してください。簡単に乾燥させることができるので。全体のプロセスは、理想的には1〜2分未満で完了します。

注入が完了したら、オーガーパッドをステージから取り外し、解剖スコープに置きます。1マイクロリットルのM nineバッファーを注入したワームに直接塗布します。これには、ピペットの先端をハロー炭水化物オイルの表面の下に沈める必要がある場合があります。

バッファーはワームを再水和し、エアロパッドの表面から浮き上がり、ワームピックを使用してワームを通常のプレートに移します。次に、注入した線虫をアダムに渡し、彼はトランスジェニック系統の選択と維持方法を見せてくれます。注入されたワームは、個々の新鮮な播種された60ミリメートルプレートに移され、繁殖させることができます。

これらのワームは P ゼロ世代を表します。通常、注射された動物は、子孫が現れるまで摂氏20度で2〜3日間インキュベートされます。子孫が現れたら、トランスジェニックワームのスクリーニングを開始する準備が整います。

F1の子孫は、トランスジェニックマーカーの証拠として観察されます。この場合、選択可能なマーカーは蛍光性であるため、蛍光実体顕微鏡を使用してスクリーニングできます。各蛍光キャリアF1動物は、新しいプレート上に別々にクローニングされます。

注入されたPゼロは、そのすべてのF1のうち1〜5個の蛍光子しか生成できません。F1雌雄同体が子孫が現れるまで、2〜3日間20度で繁殖させます。F 2世代の準備が整うと、トランスジェニック動物でも観察されます。F遺伝子組み換えマーカーを継承し発現した2匹の動物は、安定系統と考えられる。

各独立した安定系統は、線虫の別々の系統が各系統を伝播し、各世代でいくつかのトランスジェニック動物を新しいプレートに移すことによって維持されるべきである。これは、蛍光実体顕微鏡を使用して実行する必要があります。選択可能なマーカーが遺伝子コピー数の変動を制御するために蛍光性である場合、注入されたコンストラクトごとに少なくとも3つの独立した安定ラインを生成します。

ここでは、発現のマイクロインジェクション、ベクトルコンストラクト、エルガンの観察方法、安定したラインの選択方法を紹介しました。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。