結核および多剤耐性結核の診断のためのMODSの方法

世界の3人に1人が結核に感染しています。活動性結核の診断は、活動性結核の患者が治療を受けるか死ぬまで、年間10〜15人の他の人々に感染し続けるため、新たな感染を防ぎます。Modsは、顕微鏡観察、薬物感受性アッセイ、およびそれが呼ばれる理由が方法論が説明されるにつれて明らかになる理由を言う必要がないようにするために使用する頭字語です。

短いビデオでは、結核と多剤耐性結核の迅速で安価な診断のためのmods方法論を概説します。ビデオでは、方法論を段階的に説明します。液体培養を扱うことによるバイオセーフティーへの影響について説明し、この方法論の使用に必要な重要な品質保証の問題についても説明します。

modsアッセイは、ペルーのリマにあるカヤナ大学のBob Gilmanの研究室で開発されました。ルーズキャビによって最初に行われた観察に続く。LOOSEは、比色指標を使用して培養中の結核菌を迅速に検出する方法を特定しようとしていました。

しかし、彼女は、顕微鏡下でのこれらの培養物の観察により、Colormetricインジケーターの色が変わる数日前に微生物の増殖の存在が明らかになったことを指摘し、その観察に基づいてMODのアッセイが開発されたと述べました。MODのアッセイは、リソースが限られた環境で開発され、リソースが限られた設定を対象としているため、結核の液体培養ベースの検出および多剤耐性検出の試験あたり3弱です。これは非常に魅力的で、リソースが限られている場所に初めてそのような診断能力をもたらします。

したがって、modsアッセイは3つの中心的な原則に基づいています。1つ目は、結核菌は、固体培地よりもはるかに急速に液体培地で増殖することです。これは長年前から知られている事実です。

第二に、これらの液体培地を顕微鏡で観察すると、固体培地上のコロニーの巨視的な出現を待つよりもはるかに迅速にmyb結核の成長を検出できるということです。そして実際、その成長は完全に特徴的であり、液体培地中の結核菌を細菌や真菌の汚染と区別したり、実際に存在する可能性のある非定型非結核性抗酸菌の増殖と区別することができます。最後に、これはおそらくmodsアッセイの最もエキサイティングな点ですが、リファンピシンという薬を組み込むことができるため、喀痰から直接多剤耐性を得ることができます。

アッセイの最初にこれらの薬剤を使用することで、結核の両方を検出すると同時に、分離株がこれら2つの薬剤に耐性があるかどうかを検出することができます。そして、これにより、間接的な薬物感受性テストをサブカルチャーして作成する必要がなくなります。それでは、modsアッセイを行うために必要な機器の概要を説明します。

準備したメディアを保管するには、冷蔵庫が必要です。isとリファンピンの重さを量るには天びんが必要です。痰を混ぜるには渦が必要です。

除染の解決によって、遠心分離機は除染された喀痰のサンプルを集中するために必要とされ、これは3000 G.The遠心分離機を冷蔵する必要がないが、絶対にbios安全であること、bios安全であることが絶対に必要である。マイコバクテリアの作業では、遠心分離機のバケツをロック可能な蓋で密封する必要があります。37°Cを達成し、37°Cを維持できるインキュベーターが必要です。

これはCO2を濃縮する必要はありません。倒立顕微鏡は、改造プレートを読み取るために必要であり、これは4 xと10 xの対物レンズを持つべきであり、オートクレーブは、培地を滅菌するために必要であり、また、微生物培養物の処分のためには、廃マイクロは、培地、生物学的安全キャビネットの分注のために必要である。クラス2は、喀痰サンプルの操作とプレートの接種を含む手順に必要です。

mods asayを実行するために必要な試薬は、次の通り、ミドルブルックセブンHナインメディアカシオンとグリセロールパンタ、抗生物質サプリメントとOADCです。抗生物質の栄養補助食品の在庫は、リファンピンジメチルスルホキシド、リファンピシンの調製のためのDMSO、水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、および痰の除染のためのニルシステイン、リン酸緩衝液の調製のための二、リン酸ナトリウムおよびリン酸一カリウム、感染した廃棄物の処分のための次亜塩素酸10%ナトリウム、および作業面の清掃のための消毒剤です。次のプラスチックと消耗品も必要です 滅菌ガラス管 水性溶媒用の0.2マイクロメートルフィルターと有機溶媒用の0.2マイクロメートルフィルター、マイクロ遠心分離管、15ミル遠心分離管、滅菌50ミリリットル、10ミリリットルの血清学的ペップス過去のペップス滅菌マイクロピペットチップ24ウェル組織培養タイプのプレートと密封可能なジップロックタイプのインバッグは、喀痰サンプルが培地に接種された後に置かれ

事前に準備できるストックソリューションには4つのグループがあります。リン酸緩衝液は、リン酸ナトリウム、ジバ、およびリン酸カリウム一塩基性溶液をpH 6.8±0.2に調整したものです。この溶液を摂氏121度から124度で15分間オートクレーブ滅菌し、栄養寒天培地でアリコートを培養して無菌性を確認します。

これは、摂氏2〜8度の冷蔵庫に最大1か月間保存できます。各喀痰サンプルには、10ミリリットルのリン酸緩衝液が必要です。喀痰の除染のためのストック溶液は、水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウムの組み合わせです。

これらの溶液は等量で混合され、121〜124°Cで15分間オートクレーブされ、2〜8°Cの冷蔵庫で最大1か月間保存することもできます。この溶液は、各喀痰サンプルに2ミリリットル必要です。基本的な培地は、ミドルブルックセブン、Hナイン、カシオン、グリセロールで構成されています。

7 H nine粉末をグリセロールとカシオンを含む滅菌蒸留水に溶解し、完全に溶解するまで一定の攪拌で混合します。この培地は、摂氏121〜124度で15分間オートクレーブ処理され、冷却後、滅菌された16 x 100ミリメートルのガラス管で4.5ミリリットルのクォートに分割されます。培地を37°Cで48時間インキュベートして無菌性を確認しますが、この時間経過後には濁りがなくなることが示され、キャップをしっかりと閉じた状態で2°Cから8°Cで最大1ヶ月間保存することができます。

各喀痰サンプルには、この培養物の4.5ミリリットルを含む1本のチューブが必要です。中型抗生物質原液は、以下のように調製され、滅菌蒸留水に完全溶解し、0.2μmの水性溶媒用シリンジフィルターで濾過する。その後、20マイクロリットルのアリコートをマイナス20°Cの滅菌マイクロ遠心チューブに最大6ヶ月間保存することができ、各20マイクロリットルのアリコートは最大100個のサンプルに十分です。

8ミリグラム/ミルのリファンピンストック溶液は、リファンピシンをDMSOと滅菌蒸留水に溶解することによって調製されます。.この混合物は、有機溶媒用の0.2マイクロメートルシリンジフィルターでろ過され、溶液は、マイナス20°Cで最大6ヶ月間、無菌マイクロ遠心チューブ内の20マイクロリットルアリコートに保存することができます。それでは、方法論自体の一部と、手続きの日に取るべき3つのステップについて説明します。

これは、ストックソリューションを実用的なソリューションに変換することです。まず除染ソリューションがあり、次にメディアソリューションがあります。そして最後に、薬の作業溶液はisenとRifampinです。

mods方法論に使用される除染方法は、標準化された水酸化ナトリウムナルク除染方法論です。ナルクは粘液溶解性物質であり、痰を消化し、水酸化ナトリウムが除染を行うのを助けます。このためには、水酸化ナトリウムクエン酸ナトリウムストック溶液が必要であり、その溶液の20mlに0.1グラムのNAが追加されます。

準備日に使用されなかった溶液は廃棄する必要があります。また、培地の最終調製は、使用日にのみ行う必要があります。格納された7つのHナインメディアはOADCと組み合わされ、パンタ4.5ミリリットルのメディアは、各チューブにOADCの0.5ミリリットルとパンタの0.1ミリリットルと組み合わされています。

これは1つのサンプルに十分です。各薬剤の作業溶液は使用日に調製され、活性が保証されないため、使用されなかった溶液は廃棄する必要があります。保存されたアリコートは24で希釈されます。.培地を含む喀痰サンプルが添加された後に達成される最終的な井戸濃度が1ミルあたり0.4マイクログラム、リファンピンの場合は1ミルあたり1マイクログラムであるような、培地7 H 9 oh A DCで順次組織培養プレート。

次に、除染手順では、2ミルの喀痰サンプルを円錐形のファルコンチューブに入れ、次に2ミルの水酸化ナトリウムミルク除染溶液を追加します。蓋を元に戻し、しっかりとねじ込むと、懸濁液を渦巻きにして15分間放置し、その間に除染手順が行われます。この時間の後、14ミリリットルのリン酸緩衝液を添加する。

蓋を元に戻し、しっかりとねじ込み、チューブを50分後に3000Gで遠心分離機に入れ、S上清をデカントし、残ったペレットを7 H nine OEDCパンターの5.1ミリリットルチューブを使用してプレートアウトしたいサンプルです。当社のペレットは、約2ミリリットルの容量に再懸濁されます。この再懸濁されたサンプルの半分は、バックアップとしてマイクロ遠心分離管に保存されます。

これは、培養物が汚染され、サンプルを再度プレートアウトする必要がある場合に利用できます。残りの7つのH9 oh a DCパンターにもう1ミリリットルが加えられ、これがメッキアウトの準備ができているサンプルです。この懸濁液の900マイクロリットルの培地とサンプルを、24ウェルプレートのカラム内の4つのウェルのそれぞれに入れます。

24ウェルプレートの残りのウェルは、5つのサンプルが24ウェルプレートに充填され、5つのカラムごとに1つずつ、6番目のカラムはサンプルなしで残されます。6 番目の列は、この列のネガティブ コントロールとして機能します。それは喀痰サンプルなしですべての培地成分を配置しており、この列の成長は明らかに交差汚染の問題があり、プレート全体を廃棄する必要があることを示しています。

私たちが実行するすべてのプレートには、ネガティブコントロールの列が必要です。これで、すべてのサンプルとメディアが入ったプレートができました。抗生物質懸濁液を別のプレートに追加する必要があります。

我々は、リファンピンとイシドについて前述したように希釈液を調製し、4チャンネルマルチペットを使用して、これらのウェルのそれぞれから100マイクロリットルを収集し、7つのH 9 OADCの100マイクロリットルを2つの制御ウェルのそれぞれに分配し、100マイクロリットルのリファンピンと100マイクロリットルのイシドを2つの薬物含有ウェルのそれぞれに分配します。プレートが完成したら、フタを元に戻して中に入れます。この時点から袋のジップロック袋は再び開けられないため、液体培地で成長する培養物は袋から出る機会がありません。

これ以降のプレートの読み取りは全て袋の中で行い、袋はオートクレーブ袋に入れて培養終了時に廃棄します。このようにして、マイコバクテリアの高濃度懸濁液の操作を回避します。ここで、品質管理について少しお話しします。

mods方法論には、アッセイを適切に使用するために不可欠な品質管理が組み込まれています。まず第一に、ネガティブコントロールがあり、これらはすべてのプレートで実行されます。これらは以前に述べましたが、要約すると、プレート上には他の5つの喀痰サンプルと一緒に喀痰サンプルが存在しないすべての培地成分を含む列があり、列内の井戸は他の井戸と同じように検査する必要があり、これらの井戸での成長の存在は、相互汚染が起こったことを示しており、したがってプレート上の結果は信頼できません。

したがって、プレートは廃棄し、すべてのサンプルを再メッキする必要があります。さらに、ポジティブコントロールである内部コントロールがあります。これらは別のプレートで実行され、このプレートは、ラボ内での相互汚染のリスクを最小限に抑えるために、一日の終わりに他のすべてのサンプルプレートが準備された後に準備されます。

この別のプレートでは、結核菌の完全に感受性の高い1つの株と、イシドとリファンピシンに耐性のある株を実行します。プレート上で多剤耐性株を実行することに懸念がある場合は、これら2つの感受性およびMDR株の代わりに、リファンピンモノ耐性株を単剤耐性株を使用せずに実行できます。これらの株の目的は、メディアが成長をサポートするだけでなく、したがって、私たちのすべてのポジティブコントロールは薬物を含まない富の成長を持つべきであるだけでなく、私たちの薬物濃度が正しいため、感受性の高いポジティブコントロールは、isの存在下で成長すべきではなく、リファンピンと耐性ポジティブコントロールは明らかにリファンピンとプレートに存在するISの濃度を通じて成長する必要があります。

さて、それではプレートリーディングに移りましょう。サンプラーからプレートをメッキした日を考えると、0日目のプレートの読み取りは5日目から始まります。それ以前は、マイコバクテリアの増殖はめったに見られません。

プレートは倒立光学顕微鏡で検査されます。つまり、プレートは下から上に向かって検査されるため、上から培養物を視覚化しようとするコードが非常にはっきりと見えますが、プレートの蓋の結露によって妨げられ、焦点距離が標準的な顕微鏡では不十分であるためです。顕微鏡検査は、一般に、10 x 客観的な陽性培養物を用いて行われ、両方の薬物フリーウェルに少なくとも 2 つのコロニー形成単位が存在するものと見なされます。

メディアが曇り、5日目までにほとんどの井戸が繁茂するため、汚染の存在は容易に認識されます。対照的に、マイコバクテリアの増殖は、マイコバクテリアの初期成長の曇りをもたらさず、小さなコンマのような形態を形成し、それが着実に進行して特徴的な弦やもつれを形成します。2週間以内に、強く正の成長がマイコバクテリアの集合体を形成し、その臍帯は四肢にしか見えません。

陽性になる可能性のある培養物の大部分は14日目までに陽性であるため、5日目から14日目までは毎日測定値を取得し、その後は実験室の作業負荷に応じて2〜3日ごとに測定値を取得することをお勧めします。培養物が2つの薬物フリーウェルで明らかに陽性である日には、薬物を含むウェルを読み取る必要があります。いずれかの薬物の存在下での成長は、その薬物に対する耐性を示します。.薬物を含まないウェルで陽性培養が認められてから1週間以上経過して、薬物を含むウェルの領域が行われた場合、時折画期的な成長が見られるため、これは耐性を表しない可能性があることに注意することが非常に重要です。

培養が陰性の場合、この時間以降の陽性培養は治療を受けていない患者では遭遇しないため、21日目に読み取りを停止できますインキュベーションの21日が完了すると、培養物は廃棄される場合があります。培養物はジップロックバッグ内に留まり、オートクレーブバッグに入れられ、摂氏121〜124度で45〜60分間オートクレーブに入れられ、その後安全に廃棄できます。バイオセーフティとMODアッセイについて少しお話ししますが、これはペルーだけでなく、アフリカやアジアの環境でもMOD

液体培地で微生物培養物を使用することの安全性とバイオセーフティについて、繰り返し問題が生じます。これは理解できる恐怖です、なぜなら明らかに液体がこぼれる可能性があり、固体媒体はそのリスクを伴わないからです、そしてまた、私たちがマイコバクテリアの懸濁液を扱うときにはエアロゾル化のリスクがあります。実は、このような理由から、MODの方法論は、間接的な薬剤感受性試験を必要とするどの方法論よりも安全な方法論であると考えています。

この理由は、間接的な感受性試験のために、既知の濃度の微生物の懸濁液が調製されるためです。したがって、これには、こぼれやエアロゾル化のすべての付随するリスクを伴う高濃度の微生物溶液の操作が含まれます。対照的に、modsの方法論は、ご覧のとおり、喀痰サンプルをプレートに接種し、その後プレートをビニール袋に密封するだけです。

このバッグは二度と開けられることはないので、これらの高濃度の懸濁液に対処する必要はありません。これは、改造手法が完全に安全であると信じているということではなく、マイコバクテリアの取り扱いには常にリスクが伴います。しかし、2006年に発表された韓国のデータは、モッズが他の文化をメッキするのと同じくらい危険ではないという私たちの立場を裏付けているように思われました。

これは実験室の労働者で行われた研究であり、培養物をメッキし、薬物感受性試験の責任を持たない実験室労働者の職業上のリスクは、喀痰塗抹顕微鏡検査を行っている労働者の職業上のリスクよりも大きくないことを示しました。対照的に、マイコバクテリアの懸濁液を取り扱い、薬物感受性試験を行っている人は、結核の職業リスクがはるかに高くなります。明らかに、すべての労働研究所のスタッフが可能な限り保護されることが最も重要であるため、これらの手順のいずれも、N95標準マスクを意味する適切な個人の呼吸保護なしでは実施しないことを強くお勧めします。

さらに、クラス2の生物学的安全キャビネットまたはフードが必要であり、すべての排気領域がHEPAフィルターでろ過されます。最後に、実験室内の空気の流れの乱流を避けるために非常に重要な単純なメカニズムは、サンプルの処理中に人員の出入りを停止するための実験室のドアをロックすることです。これにより、研究室内での感染リスクが軽減されますので、modsの方法論がどのようなものか、そしてリソースが限られているが高品質の結核およびMDR結核診断が緊急に必要とされている環境でどれほど役立つかについて、概要がお伝えいただければ幸いです。

詳細については、当社のWebサイト、mods peru. orgにアクセスして、詳細な標準操作手順、modsのユーザーガイドを見つけることができます。追加の肺サンプルを処理するためのSOPに加えて、マイコバクテリウムと結核、その他のマイコバクテリア、細菌と真菌の汚染の写真ライブラリもあり、品質保証戦略と、MODの使用を開始するための研究所の認定に推奨される手順も見つけることができます。

最後に、よくある質問シートがあり、これは反復的な方法論であるため、現在modを使用しているユーザーからのフィードバックを歓迎します。先に説明したように、これは非独占的なテストであり、他の研究所が何とか行った改善に常に興味を持っています。