バキュロウイルスによるチョウ目幼虫の経口感染するためのプロトコル

このビデオでは、我々は、殺虫効率を決定するために、バキュロウイルスによる鱗翅目幼虫の経口感染の手法を示します。

Vaoウイルスは、タンパク質発現のために昆虫細胞株と組み合わせて使用されるDNAベクターとして一般的に使用されています。しかし、このウイルスが効率的に昆虫に感染し、致命的な結果をもたらすという事実も、このウイルスを効果的な殺虫剤にしています。例えば、ブラジルでは、野生型バロウイルスは、殺虫効果を高めるためにベルベットマメの幼虫を制御するために、年間100万ヘクタール以上の大豆作物に適用されています。バロウイルスは、昆虫のHemosIL内で活性な昆虫特異的毒素をコードする遺伝子で遺伝子操作されています。

このビデオでは、殺虫効果を分析するために、鱗翅目の幼虫にバカオウイルスを経口感染させる方法を紹介します。こんにちは、私は眼科とアイオワ州立大学のブラインドボニング研究室から来ました、そして私は同じく骨抜き研究室のウェンディ・スパークスです。今日は、lterと幼虫のVAウイルス感染の2つの手順を紹介します。

まず、ハランは、飛沫摂食バイオアッセイを使用して新生児の幼虫に感染する方法を示します。そして、ダイエット血液バイオアッセイを使用して、中期から後期の幼虫に感染させる方法を紹介します。それでは始めましょう。

飛沫摂食バイオアッセイは、アバカビルの致死量と生存率の決定に使用できます。バロウイルスに感染した幼虫の時間。このアッセイには、通常、初期の幼虫または新生児の幼虫が使用されます。

始める前に、適切なダイエットが入ったダイエットカップが手元にあることを確認してください。また、適切なウイルスを調製します 希釈液には、緑色の食品着色料を4体積%の濃度まで含んでいます。致死的なウイルス濃度を決定するためには、希釈は1〜99%の死亡率の範囲を与える必要があります予備的なバイオアッセイは、多面体の沈降を防ぐためにチューブをボルテックスした後、ウイルス濃度の適切な範囲を決定するために必要かもしれません、60ミリメートルのシャーレにウイルス溶液の小さな液滴の2つの同心円を作ります。

使用するウイルスの濃度ごとに、ネガティブコントロールモック感染も設定することを忘れないでください。次に、滅菌ペイントブラシを使用して、25〜30匹の新生児の幼虫を同心円の中央に移します。皿に蓋をしてパラフォームで密封し、幼虫が逃げないようにします。

理想的には、治療間の汚染を防ぐために、ウイルスの種類ごとに異なるペイントブラシを使用します。皿を室温で10〜15分間放置し、その間に幼虫が飲み物を飲みます。給餌された溶液の幼虫は、緑色の食用着色料が1オンスのプラスチックカップに給餌した幼虫のみを移送することに起因する前腸の緑色の着色によって識別でき、カップごとに1匹の幼虫を食事移送します。

幼虫を移した後、カップを蓋で覆い、感染後24時間で摂氏28度でインキュベートします。死んだ幼虫が入っているカップをすべて取り除きます。これらの早期死亡は、怪我の取り扱いに起因する可能性があります。

このバイオアッセイを使用して致死量を決定する場合、模擬感染幼虫と生き残ったウイルス処理幼虫がウイルス感染幼虫を蛹化するために精製または借り始めるまで、幼虫は2〜3日ごとにチェックする必要があります。死んだ幼虫は時々、感染で死んだ幼虫を黒く変え、本質的に多面体の袋になり、完全に溶解します。この時点で機械的に乱れた場合は、各治療で幼虫の死亡率をスコアリングします。.

致死濃度バイオアッセイは、別々の機会に3回または4回再現する必要があります。各ウイルスまたは対照治療に対して、1回の投与につき30人を使用します。poloやSASなどの適切な遺言検認分析プログラムを使用して、lc 50値、95%信頼区間、および適切な統計を計算します。

この液滴供給アッセイは、ST 50の生存時間値を決定するためにも使用できます。この場合、幼虫の死亡率は4〜8時間ごとに採点され、より頻繁に観察されます。死亡率が生存期間が高い場合、バイオアッセイは lc 99 用量のウイルス生存期間中央値を使用して実行され、95% 信頼限界は Kaplan Mayer 推定器を使用して s plus または SAS プログラムを使用して計算されます。

さて、ハランが飛沫供給バイオアッセイを見せてくれたので、ダイエットプラグバイオアッセイでお見せします。中期から後期のInstar幼虫は、このアッセイを実施する前日に致死量またはLD 50を決定するために、既知の用量のウイルスで処理されたダイエットプラグに給餌されます。カップから食事を取り出して、幼虫を一晩飢えさせます。

この手順により、幼虫がウイルスを消費する速度が上がります。翌日に接種したダイエットキューブは、約2立方ミリメートルの小さなキューブにカットしてダイエットを準備します。ダイエットキューブが小さすぎると、ダイエットキューブが乾燥します。

ダイエットキューブが大きすぎると、幼虫は一晩でダイエットキューブ全体を消費できなくなります。次に、各ダイエットキューブに1〜2マイクロリットルの多面体懸濁液を追加します。懸濁液には、体積の4%の食品着色料が含まれています。

懸濁液を5〜15分間食事に染み込ませます。また、ネガティブコントロールとして、模擬ウイルスで処理されたダイエットキューブを準備することを忘れないでください。次に、各カップの4番目の幼虫に1つのダイエットキューブを移します。

次に、翌日、摂氏28度で一晩インキュベーターにカップを置き、ダイエットキューブを完全に食べていない幼虫を捨てます。次に、残りの幼虫のために各カップに大きな食事を追加します。幼虫を摂氏28度に維持し、模擬感染した幼虫と生き残ったウイルス感染幼虫が蛹化するか、蛹になり始めるまで、必要に応じて食事を追加します。

このとき、死んだ昆虫と生き残った昆虫の数を記録します。背中のウイルスに昆虫を感染させるための2つの方法、出血、摂食生検、および食事プラーク生検を紹介します。この手順を行うときは、死体vaoウイルスが殺した幼虫は通常壊れやすく、放出ウイルスを簡単に破裂させる可能性があることを覚えておくことが重要です。

そのため、作業面を滅菌し、汚染された手袋や使い捨て材料は適切な方法で廃棄して、汚染を防ぎます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。