バキュロウイルスによるチョウ目幼虫のMicroapplicatorアシスト感染するためのプロトコル

節足動物特異的なバキュロウイルスは、真核生物タンパク質発現システムの標準的な研究ツールとして使用されていますが、自然界の鱗翅目などの植食性昆虫を死滅させることができる、環境に安全な殺虫剤としても開発されています。鱗翅目の幼虫は、感染した葉を食べることでバキュロウイルスに感染します。幼虫（キャタピラー）は、ポリヘドロンと呼ばれる形態でバキュロウイルスを摂取します。これは、ウイルス粒子が大きな結晶性タンパク質構造に包まれた複合体であり、ウイルスを乾燥から保護する役割を果たしています。

幼虫が感染すると、取り込まれたウイルスが昆虫体内で感染を拡大させます。ウイルスは宿主の核酸およびタンパク質合成機構を乗っ取り、さらに多くのウイルス粒子とポリヘドラを生成します。最終的に、幼虫はウイルスに完全に感染してポリヘドラの粘液状の塊となって溶解し、それが昆虫が食害する植物の表面に滴り落ちることで、サイクルが再び始まります。これにより、特定のBaculovirusの殺虫 efficacy を判定します。

Avir株のマイクロアプリケーター技術とバイオアッセイを組み合わせることが可能です。Leid dorinの幼虫にウイルスを血腔または体腔へ直接注入して感染させ、死亡率を評価できます。さらに、経口マイクロアプリケーターを用いた注入によってポリヘドラを感染させ、腸管およびその他の組織への感染タイミングを解析することができます。

こんにちは。アイオワ州立大学昆虫学科のBrian e boning研究室のWendy Sparksです。また、boning snapにも所属しています。本日は、ラボ飼育のduct DIにバックログウイルスを感染させる2つの手順をご紹介します。どちらの方法でもマイクロアプリケーターを使用します。

まず、マイクロアプリケーターを用いて、プロール経由でヘニにウイルスを導入する方法を示します。次に、マイクロアプリケーターを用いて、マウス経由でミッドガードにポリヘッダーを導入する方法を示します。それでは始めていきましょう。

殺虫目的で開発される際、バクロウイルスは通常、害虫幼虫への経口感染を促進するためにポリヘドロン遺伝子を含んでいます。しかし、場合によっては、ポリヘドロン陰性のバクロウイルスの潜在的な殺虫効果を試験したり、昆虫の腸管を回避したりする必要があることがあります。このような場合、アッセイを開始する前に、マイクロアプリケーターを用いてバクロウイルスを注入し、幼虫に感染させることができます。

プラークアッセイまたはエンドポイント希釈法を用いて、ウイルス作動液のタイターを決定してください。生理学的実験では、5齢のH VNS 1個体あたり5×10⁴ PFUを注入するのが一般的です。このバイオアッセイを開始するには、希釈したウイルス液を、28.5または32ゲージの鋭利な針先を装着した1 ccのプラスチック製ハミルトンシリンジに充填します。

通常、1 mLあたり10⁷〜10⁸のタイターを持つウイルス溶液を、幼虫1匹につき1〜3 µL使用します。そのため、ほとんどの場合、シリンジに300〜500 µLを充填すれば十分です。次に、シリンジを垂直に保持して空気を針先に集め、押し出して気泡を取り除きます。

次に、シリンジをシリンジサポートチューブに固定します。分量を1.0 µLに設定してください。マイクロアプリケーターのマイクロプロセッサ制御ユニットで、各ドロップレットについて、まず制御ユニットを校正して正確な量であるかを確認します。ドロップレットの吐出速度は、0から9のスケールで設定可能です。

通常、0から1の範囲が使用されます。フットスイッチを押し、溶液が適切に分注されることを確認してください。溶液の分注量が多すぎる場合や、塗布速度が遅すぎる場合は、適切な量の溶液が正しい速度で塗布されるまで、量と速度の設定を調整できることを覚えておいてください。

それでは、H VNS感染のための注入を開始します。通常、5齢幼虫の初期段階で注入を行います。後期の齢になるとサイズが大きくなるため、注入作業が容易になります。針先を前脚のいずれかの底面に刺し、体腔内へと挿入してください。

注意点として、針先を穿刺口に挿入する際、腸管や体壁を傷つけないように幼虫の体の位置を調整してください。次に、フットスイッチを4回押し、ウイルス溶液 4 µL を血腔内に注入します。注入完了後、すべての幼虫を 28 °C のインキュベーターに戻します。死んでいる幼虫がいないか頻繁に確認し、生存している幼虫に十分な餌が与えられていることを確認してください。

終齢幼虫は、注射による角質層の損傷で死亡することはありませんが、細菌感染に起因する中腸の損傷が発生する可能性があるため、注射から24時間後に幼虫の状態を確認する必要があります。この早期死亡個体はデータ解析から除外してください。致死濃度バイオアッセイに、ウイルスを塗布したマイクロアプリケーターによるバイオアッセイを用いる場合は、異なる日に3回または4回、バイオアッセイを反復して実施してください。

各ウイルスまたは対照処理につき、1用量あたり30個体を使用します。lc 50値、95%信頼区間、および適切な統計量を算出するために、poloやSASなどの適切なプロビット分析プログラムを使用してください。このバイオアッセイは、一定量のウイルスを接種した後のST 50生存時間を決定するためにも利用可能です。

本ケースでは、幼虫の死亡率を4〜8時間ごとにスコアリングし、より頻繁に観察を行います。死亡率が高い場合は、S-PLUSまたはSASプログラムを用いてカプラン・マイヤー法により、95%信頼限界における生存期間中央値を算出します。以上で、ハランによるバクテリオファージを用いたマイクロアプリケーター補助バイオアッセイの解説を終わります。

アッセイの手順を説明します。ポリヘドラを用いた方法についてです。感染の正確なタイミングが重要である場合は、ポリヘドラを昆虫の腸内に直接経口接種します。例えば、昆虫体内でのウイルスの拡散をモニタリングする場合、このアッセイを開始するために、ポリヘドラをグリセリンと水の3:2の中性浮遊溶液に10〜300の濃度で懸濁させます。

例えば、4齢幼虫の接種にポリヘドロンを使用できます。次に、この溶液を32ゲージの鈍端針を装着した1 CCのプラスチック製またはガラス製結核用注射器に充填します。顕微鏡で覗きながら、マイクロアプリケーターの支持チューブに注射器をセットします。

4齢または5齢の星状幼虫を保持し、針を口から挿入して中腸の前部まで進め、ポリヘドラを注入します。この手法にはある程度の練習が必要です。まず、手袋を着用した状態で、幼虫を潰さずに保持することに苦労する場合があります。

次に、口器を避けて針を刺すにはある程度の練習が必要です。PBSを用いて約30匹の幼虫で接種の練習を行うことを推奨します。万が一、腸を穿刺してしまった場合は、幼虫が速やかにメラニン化して黒くなるため、すぐに判別できます。

繰り返しになりますが、マイクロアプリケーターを用いた経口接種は正確な感染時間を特定できるため、昆虫体内でのウイルスの拡散機序を決定するために感染時間が重要となる実験において最も有用です。例えば、β-ガラクトシダーゼを発現するウイルスを幼虫に経口接種し、その後さまざまな時点で解剖を行うことで、どの組織がいつ感染するかを判定できます。ここでは、マイクロアプリケーターを用いた2種類の感染方法を示します。1つ目は、ウイルスによる直接接種で、腹脚経由で接種する方法です。これにより、腸管の生理的影響を回避して、目的とするウイルスの致死性や致死時間を評価することが可能になります。

2番目の手法は、ポリヘドラを用いた中腸への直接接種です。これにより、非常に正確な用量を中腸に直接投与できるだけでなく、イベントのタイミングを極めて精密に制御することが可能になります。そして、ウイルスの致死率やその他の表現型についても研究することができます。

この手順を行う際は、cadavers baula virusによって殺された幼虫は通常脆弱であり、容易に破裂してウイルスを放出する可能性があることに留意することが重要です。したがって、汚染を防ぐために、作業面を滅菌し、汚染された手袋や使い捨て材料を適切な方法で廃棄してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。