バキュロウイルスによるチョウ目幼虫のMicroapplicatorアシスト感染するためのプロトコル
2008年8月23日
このビデオでは、我々は、殺虫効率を決定するために、バキュロウイルスによる鱗翅目幼虫の感染させるために使用される2つのmicroapplicatorの手法を示します。
節足動物特異的バッカラウイルスは、真核生物のタンパク質発現系の標準的な研究ツールとして使用されていますが、鱗翅目などの草食動物を自然界で殺すことができる環境に安全な殺虫剤としても開発されています。鱗翅目の幼虫は、感染した葉を食べるとバッカラウイルスに感染します。幼虫または幼虫は、ウイルスを乾燥から保護する大きな結晶性タンパク質構造に包まれたウイルス粒子の複合体である多面体として知られる形でバッカラウイルスを摂取します。
幼虫が感染すると、バテッドウイルスが昆虫内に感染を広めます。ウイルスは宿主の核酸とタンパク質の合成機構を乗っ取り、より多くのウイルスと多面体を作ります。最終的に、幼虫はウイルスに徹底的に感染し、昆虫が食べた植物の表面に滴り落ちる多面体の乱雑な滲出液に溶解し、その後、特定のバカの殺虫効果を決定するためのサイクルが新たに始まります。
Avir株マイクロアプリケーター技術とバイオアッセイを組み合わせることができます。Leid Dorinの幼虫は、HemosILまたは体腔に直接突き合わせたウイルスを注射することで感染し、死亡率を評価できます。さらに、経口マイクロアプリケーター支援注射を使用して幼虫を多面体に感染させることができ、腸や他の組織の感染タイミングをアッセイできます。
こんにちは、私はアイオワ州立大学の昆虫学部のブライアンe骨抜きの研究室のウェンディスパークスですそして、私も骨抜きスナップから来ています。今日は、ラボダクトDIをバックログウイルスに感染させるための2つの手順を紹介します。どちらの方法でもマイクロアプリケーターを使用します。
まず、マイクロアプリケーターを使用して、プロレを介してヘニに体内ウイルスを送達する方法を示します。次に、マイクロアプリケーターを使用して、マウスを介してポリヘッダーをミッドガードに配信します。それでは始めましょう。
殺虫目的で開発されたバロウイルスには、通常、害虫の幼虫の経口感染を促進する多面体遺伝子が含まれています。ただし、多面体陰性のバッカラウイルスの潜在的な殺虫効果をテストしたり、昆虫の腸をバイパスしたりする理由がある場合があります。この場合、アッセイを開始する前に、マイクロアプリケーターを用いたバテッドウイルスの注入を行い、幼虫に感染させることができる。
バテッドウイルスのワーキングストックの力価は、プラークアッセイまたはエンドポイント希釈アッセイを使用して決定する必要があります。生理学的実験では、5 instar H VNS ごとに 4 番目の PFU に 10 の 5 倍の注射が一般的です。このバイオアッセイを開始するには、28.5または32ゲージの鋭い針先を備えたプラスチック製の1ccからヘラクレス注射器に各バテッドウイルス希釈液をロードします。
通常、1〜3マイクロリットルのバテッドウイルス溶液です。10から7番目の力価で、1ミリリットルあたりマイナス10から8番目のものを各幼虫に使用することができ、シリンジに300〜500マイクロリットルを装填するだけでほとんどの目的に十分です。次に、シリンジを直立させてシリンジから気泡を送り出し、針先に空気を送り込んで分注します。
次に、シリンジをシリンジサポートチューブに固定します。次に、容量を1.0マイクロリットルに設定します。マイクロアプリケーターのマイクロプロセッサ制御ユニットの液滴ごとに、最初に制御ユニットを校正して、正しい量が分注され、液滴が分注される速度を0〜9のスケールで設定できるようにします。
0 から 1 の範囲が一般的に使用されます。フットスイッチを押して、溶液が適切に分配されていることを確認します。溶液が過剰に分注される場合、または塗布が遅すぎる場合は、適切な量の溶液が正しい速度で適用されるまで、容量と速度の設定を調整できることに注意してください。
これで、H VNS感染症の注射を開始する準備が整いました。第五に、幼虫は通常、後の幼虫の大きいサイズが注入プロセスを容易にする注射されます。針先をプロ脚の1つの平面から体腔に挿入します。
針先がプロレに挿入されたら、幼虫の体の位置を変更します 腸と体壁の損傷を避けるために、フットスイッチを4回押して、4マイクロリットルのウイルス溶液をヘモシールに供給します。注射が完了したら、すべての幼虫を摂氏28度のインキュベーターに戻します。死んだ幼虫を頻繁にチェックし、生き残った幼虫に適切な食事が利用可能であることを確認してください。
後期幼虫は注射によるキューティクルの損傷で死亡しませんが、細菌感染による腸の損傷に備えて、幼虫は注射の24時間後にチェックする必要があります。この早期死亡は、データ分析から除外されるべきである。致死濃度バイオアッセイにバテッドウイルスを用いたマイクロアプリケーター支援バイオアッセイを使用する場合、バイオアッセイは別々の機会に3〜4回複製する必要があります。
各ウイルスまたは対照治療に対して、1回の投与につき30人を使用します。poloやSASなどの適切な遺言検認分析プログラムを使用して、lc 50値、95%信頼区間、および適切な統計を計算します。このバイオアッセイは、固定用量のウイルス接種後のST 50生存時間値を決定するためにも使用できます。
この場合、幼虫の死亡率は4〜8時間ごとに採点され、より頻繁に観察されます。死亡率が高い場合、生存時間の中央値95%信頼限界は、Kaplan Meyer推定量、s plusまたはSASプログラムを使用して計算されます。さて、ハランがバテッドウイルスを使用したマイクロアプリケーター支援バイオアッセイを見せてくれました。
アッセイをお見せします。多面体の使用 多面体を昆虫の腸に直接経口接種することは、感染の正確なタイミングが重要な場合に使用されます。例えば、ウイルスが昆虫内でどのように拡散するかをモニタリングする場合、このアッセイを開始するには、グリセリンと水の中性浮力3〜2溶液に多面体を10〜300の溶液で懸濁します。
多面体は、たとえば、4番目の星の時間に使用できます。次に、この溶液をプラスチックまたはガラスのCCツベルクリンシリンジに32ゲージの鈍い先端針でロードします。マイクロアプリケーターのサポートチューブにシリンジをセットし、顕微鏡を見下ろします。
星の幼虫に4番目または5番目を保持し、針を口から中腸の前部に挿入してから、多面体を送達します。このテクニックには、ある程度の練習が必要です。まず、幼虫をつぶさずに手袋で保持するのは難しい場合があります。
次に、針を口の部分を超えてナビゲートするには、ある程度の練習が必要です。約30匹の幼虫にPBSを接種する練習をすることをお勧めします。あなたが腸に穴を開けることが起こった場合、幼虫はメラニーとかなり速く黒くなったので、それは明らかになります。
繰り返しになりますが、マイクロアプリケーター支援経口接種は正確な感染時間を提供するため、この方法は、ウイルスが昆虫内でどのように広がるかを決定するために感染時間が重要な実験に最も役立ちます。例えば、β galactoses daseを発現するウイルスは、幼虫に経口接種することができ、その後、さまざまな時点で解剖して、どの組織が感染するかを決定します。virとの昆虫の愛、その最初のものは、バテッドウイルスのプロレッグを介した直接接種であり、これにより腸の生理機能をバイパスし、興味のあるウイルスの致死率と致死時間を評価することができます。
2つ目の技術は、多面体を用いた中腸への直接接種でした。これにより、非常に正確な線量を直接中腸に送達できるだけでなく、イベントの非常に正確なタイミングを制御することができます。その後、ウイルスの死亡率やその他の表現型も研究できます。
この手順を実行するときは、バウラウイルスが殺した幼虫は通常壊れやすく、ウイルスを放出して簡単に破裂する可能性があることを覚えておくことが重要です。そのため、作業面を滅菌し、汚染された手袋や使い捨て材料は適切な方法で廃棄して、汚染を防ぎます。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験がうまくいくことを願っています。
概要
このビデオは、昆虫殺効性を評価するために、バキュロウイルスで鱗翅類の幼虫に感染させる2つのマイクロアプリケーター技術を示しています。これらの方法には、ウイルスの直接注入とポリヘドラの経口投与が含まれます。
主要な研究要素
科学の分野
- 昆虫学
- ウイルス学
- 殺虫剤研究
背景
- バキュロウイルスは真核生物タンパク質発現の研究に使用されています。
- これらは環境に優しい殺虫剤として開発されています。
- 鱗翅類の幼虫は感染した葉を摂取することで感染する可能性があります。
- ウイルスは幼虫を多面体状の液体に溶解させ、感染サイクルを継続させることができます。
研究目的
- バキュロウイルスで幼虫に感染させる方法を示す。
- 異なるバキュロウイルス株の殺虫効果を評価する。
- 幼虫の死亡率を評価するバイオアッセイのプロトコルを提供する。
使用された方法
- 幼虫の血リンパ腔へのウイルスの注入。
- 幼虫の腸へのポリヘドラの経口投与。
- ウイルス溶液の正確な投与のためのマイクロアプリケーターの使用。
- 死亡率と感染のタイミングの評価。
主要な結果
- 両方の方法が鱗翅類の幼虫にバキュロウイルスを効果的に感染させます。
- 注入によりウイルス効果の制御された評価が可能になります。
- 経口投与は感染のタイミングに関する洞察を提供します。
- バイオアッセイにより、致死濃度と生存時間を決定できます。
結論
- マイクロアプリケーター技術はバキュロウイルス感染の研究に効果的です。
- これらの方法は、バキュロウイルスの殺虫剤としての可能性を評価するのに役立ちます。
- さらなる研究により、さまざまな応用のためにこれらの技術を最適化できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise delivery of viral agents to insect models enables mechanistic de-risking of baculovirus-based biopesticides by isolating infection variables and quantifying dose-response relationships. This supports target validation in entomological pathways and predictive confidence in lethality assays prior to field deployment. The method aids in screening viral strains for insecticidal potency and informs go/no-go decisions in early-stage biologics development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering controlled doses of baculovirus to bypass gut physiology and assess direct tissue effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through standardized microapplicator-assisted injection of budded virus into the hemocoel.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by isolating infection timing and dissemination patterns for lethal phenotype assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling oral inoculation of polyhedra into the midgut with precise temporal control.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through calibrated microapplicator delivery of defined virus titers (10⁷–10⁸ PFU/mL).
- Scalability Value: Highlights screening readiness via replication of bioassays three to four times with 30 individuals per dose for LC₅₀ determination.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant systems by enabling study of virus dissemination in tissues following gut-targeted or systemic infection.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by measuring mortality and survival time (ST₅₀) using Kaplan-Meier estimator.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on viral strain selection based on lethal concentration and survival time outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing by enabling quantitative infection modeling in lepidopteran hosts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise delivery of virus to specific tissues (hemocoel or midgut) to isolate mechanisms of pathogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through standardized microapplicator protocols for delivering polyhedra or budded virus with volume control (1.0 µL droplets) and speed settings (0–1 scale).
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as mortality scoring every 4–8 hours, LC₅₀ calculation via Polo or SAS, and ST₅₀ estimation using Kaplan-Meier analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling time-resolved dissection of infected larvae to track tissue-specific infection dynamics.
- Enterprise Reuse: Frames the microapplicator as a reusable platform for standardized viral challenge across insecticidal R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in infection routes, and clarification of viral dissemination kinetics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viral delivery via microapplicator calibration and syringe-based dosing.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency in strain screening, and reduced late-stage biological risk in biopesticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of baculovirus strains based on quantified lethality and infection timing data.
Implementation Considerations
- Required expertise in entomological handling, microapplicator operation, and bioassay design.
- Instrumentation includes microapplicator with microprocessor control, syringe support tube, 28.5–32 gauge needles, and incubators at 28°C.
- Cross-team standardization requires consistent virus titer determination (plaque or endpoint dilution), volume calibration, and mortality scoring protocols.
- Adaptation considerations include larval instar selection (early fifth instar for injection, fourth/fifth for oral), gut integrity monitoring, and avoidance of bacterial contamination post-injection.
- Practical limitations include larval fragility post-infection, need for sterile disposal of cadavers, and exclusion of early mortality from injection trauma.
