Name: シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶ シグマの非特異的プロテアーゼ活性アッセイ法。カゼインを基質とし、チロシン遊離による比色定量でプロテアーゼ活性を測定する標準化された品質管理手法です。

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アッセイを開始する前に、我々は、以下の試薬が正しく準備されていることを確認する必要があります。 <ol><li> 50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.5の。カリウムphospate二塩基、水を精製し、1M HClでpHを調整するの三水和物11.4 mg / mlのを使用して準備します。この溶液を37で使用する° Cの前に配置されます。 </li><li> 50mMリン酸カリウム緩衝液中でカゼインの6.5 mg / mlに混合して調製した0.65％重量/容積カゼイン溶液、。均一な分散が達成されるまで徐々に緩やかに攪拌しながら溶液の温度は℃で約10分間80から85に増​​加した。それは解決策を沸騰しないように非常に重要です。 NaOHとHClで必要に応じてpHを調整されます。 </li><li>精製水を6.1Nの株式1時55分を希釈した110 mMのトリクロロ酢酸溶液を、。トリクロロ酢酸は強酸であり、取り扱いには注意してください。 </li><li> 0.5mMのフォリン＆Ciolcalteaの、または直接プロテアーゼの活性に関連する測定可能な色の変化を生成するチロシンと反応するソリューションですフォリンのフェノール試薬、。フォリンのフェノール試薬は酸であり、取り扱いには注意してください。 </li><li>精製水にanyhydrous炭酸ナトリウム53 mg / mlのを用いて調製した500mMの炭酸ナトリウム溶液、。 37 5mMの酢酸カルシウムと10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH7.5、で構成される酵素希釈液を、℃のこのソリューションは、我々は固体プロテアーゼのサンプルを溶解または酵素液を希釈するために使用するものです。 </li><li> 1.1 mmのL -チロシン標準原液。精製水に0.2 mg / mlのL -チロシンを用いて調製し、チロシンが溶けるまで穏やかに加熱。カゼインと同様に、このソリューションを沸騰されません。 L -チロシン標準を室温に戻します。このソリューションは、当社の標準曲線を作成するためにさらに希釈されます。 </li><li>プロテアーゼ溶液。使用する直前に、ステップ6で準備酵素希釈液にプロテアーゼを溶解する。 </li></ol>必要に応じて、0.1〜0.2単位/ mlに酵素希釈液を用いて溶解されている所定の活動の固体プロテアーゼのサンプルを、使用してください。このソリューションは、品質管理アッセイの陽性コントロールとして、我々は酵素活性を決定するために実行する計算のための検証として提供しています。 プロテアーゼアッセイや標準曲線を設定する<ol><li>このアッセイを開始するには、約15 MLSを保持する適切なバイアルを見つける。テストされる各酵素について、4つのバイアルが必要です。 1バイアルは、空白として使用され、そして3人は、プロテアーゼの三希釈液のアッセイの活動に使用されます。お互いに最​​終計算をチェックする際に三希釈に便利です。 <ol><li> fourバイアルの各セットに、私たちの0.65％カゼイン溶液の5mlsを追加。それらを37℃の水浴中で平衡化させて° Cを約5分間。 </li><li>酵素の試験のサンプルバイアルの3つにテストされるソリューションではなく、ブランクの様々なボリュームを追加します。ちょうど10分間37 ° Cのために渦巻くとインキュベートして混合。このインキュベーション時間中のプロテアーゼ活性およびチロシンの必然的な解放は、測定および試験サンプル間で比較されるものです。 </li></ol></li><li>この10分間のインキュベーション後、反応を停止するには、各チューブにTCA試薬の5mlのを追加します。次に、各チューブ内の酵素溶液の最終体積が1ミリリットルになるように、、各チューブにさえブランクを酵素溶液の適切な量を追加します。これは、酵素自体の吸光度値を考慮すると、各チューブに最終容量が等しいかどうかを確認するために行われます。 37ソリューションをインキュベート℃で30分間。 この30分間のインキュベーションの間に、あなたのチロシン標準希釈液をセットアップすることもできます。簡単に8 MLSを保持できる6 DRAMバイアル（ドラムのバイアルは、ポリプロピレンチューブに置換することができます）を使用してください。 0.05、0.10、0.20、0.40、0.50シックスバイアルに、MLSに以下のボリュームで1.1 mmのチロシン標準のストック溶液を加える。空白に任意のチロシン標準を追加しないでください。下の規格は、ほとんど色の変化が得られる不純なテストサンプル用に必要になる場合があります。チロシン標準溶液を添加した後は、2 MLSのボリュームをもたらすための基準の各々に精製水の適切な量を追加します。 </li><li> 30分間のインキュベーションの後、試験溶液と0.45ミクロンポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用して空白の各フィルタをかける。ろ過は、サンプルから任意の不溶物を除去するために必要です。 <ol><li>少なくとも8 MLSを保持できる4ドラムバイアルにろ過2テストサンプルのMLSと空白のろ液を追加。規格が準備されたバイアルの同じタイプを使用することができます。 </li><li>規格と標準空白を含むバイアルのすべてに、炭酸ナトリウムの5mlsを追加。最良の結果を得るには、すぐ後にフォリン試薬1mlを加える。 </li><li>フォリン試薬の添加によって作成された任意のpHの低下を調整するために炭酸ナトリウムを追加。 </li><li>テストサンプルとTESに炭酸ナトリウムを追加tのブランク。これらのソリューションは、炭酸ナトリウムの添加後に濁ってくる。無料のチロシンと主に反応するフォリン試薬を、追加。 </li><li>渦巻きによってDRAMのバイアルを混合し、30分間37℃でインキュベートする。 </li></ol>このインキュベーション後に、基準がチロシン付加量と相関する色のグラデーションを持っていることに気付くはずです。チロシンの最高濃度は、最も濃い色に現れる。また、私たちのテストサンプルでかなりの色の変化に気づくことができる。これらのソリューションの2mlsは、適切なキュベットに0.45ミクロンポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用してフィルタリングされます。アッセイが行われるので、今度は私たちの吸光度値を記録するために分光光度計に進むことができます。 </li></ol>吸光度を測定し、酵素活性の計算<ol><li>サンプルの吸光度は、660nmの波長を用いて分光光度計によって測定されます。光パスは、1センチメートルに設定されています。規格、標準的な空白、別のテストサンプル、およびテストのブランクの吸光度値を記録します。すべてのデータが収集された後、標準曲線を作成することができます。曲線を生成するために、標準と標準のブランクの間の吸光度の差を計算する必要があります。これは、標準溶液中のチロシンの量に起因する吸光度の値です。この簡単な計算の後、Y軸上の私たちの基準の吸光度の変化に対し、X軸上の私たちの5標準の各マイクロモルの量をプロットするグラフプログラムを使用して標準曲線を作成します。 <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center">チロシン標準の音量</th><th style="text-align:center">チロシンuMoles </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li>データ点を入力したら、最高のフィット感と、対応するスロープ式のラインを生成する。 試験サンプルの吸光度とテストのブランクの吸光度との差を計算することにより、テストサンプルの吸光度の変化を見つける。スロープ式にテストサンプルの1つのための吸光度値を挿入し、解決することは、この特定のタンパク質分解反応中のチロシン解放のマイクロモルになります。 / mlあたり単位で酵素の活性を得るために、次の計算を実行します。 （umoleチロシン同等物が放出さ）×（11） 単位/ mlの酵素= __________________________________________ （1）×（10）×（2） アッセイの11 =総体積（ミリリットル） アッセイの10 =時間（分単位）単位の定義に従って 1酵素の酵素の=ボリューム（ミリリットル）を使用 比色定量に使用されている2 =ボリューム（ミリリットル） 斜面の方程式から得られるマイクロモルのチロシンに相当リリースの数を取り、我々の場合に11mlsであるMLS、のアッセイの合計量を掛けます。他の3つの量がこの値を分ける：（のは1ミリリットルを使用できるように）変化させた我々は10分間実行したアッセイの時間、、アッセイで使用される酵素の量、、比色検出に使用されるミリリットルの容積、これかもしれないあなたのキュベットに基づいて異なります。私たちは2 MLSを使用する。 </li><li> &quot;ユニット&quot;と呼ばれるプロテアーゼ活性の分収率の測定に時間で割ったチロシンのマイクロモル。私たちは、単位/ mlの条件で酵素活性のmeasurmentを残して、分子と分母の体積測定の単位を取り消すことができます。酵素希釈液で希釈した固体プロテアーゼのサンプルでのアクティビティを決定するために、我々はmg / mlで、もともとこのアッセイで使用される固体の濃度で単位/ mlで私たちの活動を割ります。、単位/ mgの面での活動を私たちに残して。 ユニット/ ml酵素 単位/ mgの固体= _____________________ MGソリッド/ mlの酵素 </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

私達はちょうどシグマのユニバーサルプロテアーゼ活性のアッセイを用いてプロテアーゼ活性を分析する方法を示してきました。さらに、このアッセイでは、実験のためにそれらを受け取る前に、私たちのプロテアーゼが正確に活動を決定していることを確認するのに便利です。これまで見てきたように、この手順を実行するとき、それは徐々にではなく、それらを沸かすためにカゼインおよびチロシンソリューションの両方を加熱することを忘れないように極めて重要です。また、それは両方の規格のために、あなたが持っている各テストサンプルのための別のブランクを準備することが重要です。

<table><tbody><tr><td>プロテアーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム 三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>カゼイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu フェノール試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム 無水物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム 三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン フリーベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

プロテアーゼはペプチド結合を切断。ラボでは、それはしばしば測定および/またはプロテアーゼの活性を比較する必要があります。シグマの非特異的プロテアーゼ活性のアッセイは、我々は品質管理の手順の中でやっているプロテアーゼの活性を、決定するために標準化された手順として使用できます。このアッセイでは、カゼインが基質として機能します。我々がテストしているプロテアーゼはカゼインを消化するときに、アミノ酸のチロシンが他のアミノ酸とペプチドフラグメントと一緒に遊離させる。フォリンとCiocalteusフェノール、またはフォリン試薬は、主に定量化し、分光光度計で吸光度値として測定される青色の発色団を、生成する無料のチロシンと反応する。カゼインから解放されより多くのチロシン、より多くの発色団が生成され、プロテアーゼの活性を強く。プロテアーゼの活性によって生成された吸光度はマイクロモルのチロシンの量と吸光度の変化を関連させるFC試薬とチロシンの既知量を反応させることによって生成された標準曲線と比較されています。標準曲線からタンパク質分解酵素サンプルの活性は、毎分カゼインから遊離チロシン同等物のマイクロモルの量である、ユニットの観点から決定することができます。 中国語のこの記事を表示するには、 <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">ここをクリック</a>

プロテアーゼはペプチド結合を切断。ラボでは、それはしばしば測定および/またはプロテアーゼの活性を比較する必要があります。シグマの非特異的プロテアーゼ活性のアッセイは、プロテアーゼの活性を決定するために標準化された手順として使用できます。

プロテアーゼはペプチド結合を分解します。研究室では、プロテアーゼの活性を測定および／または比較する必要が頻繁にあります。Sigma社の非特異的プロテアーゼ……

プロテアーゼは、実験室においてペプチド結合を分解します。プロテアーゼの活性を測定、あるいは比較することがしばしば必要となります。Sigma社のユニバーサル・プロテアーゼ活性測定法は、プロテアーゼ活性を決定するための標準的な手順として利用でき、これは当社の品質管理手順においても実施されています。本アッセイでは、テスト対象のプロテアーゼがカゼインを消化する際の基質としてカゼインが機能します。これにより、他のアミノ酸やペプチド断片とともにアミノ酸のチロシンが遊離します。遊離したチロシンがフォールマン・シールカルल्शियमフェノールまたはフォールマン試薬と反応して青色の発色団を生成し、これを分光光度計を用いて吸光度として定量・測定します。カゼインから放出されるチロシンの量が多いほど、より多くの発色団が生成され、プロテアーゼの活性が強くなります。プロテアーゼの活性によって生成された吸光度値は、既知量のチロシンをFC試薬と反応させて吸光度の変化を相関させた標準曲線と比較されます。標準曲線から得られたマイクロモル単位のチロシン量に基づき、プロテアーゼサンプルの活性をユニット単位で決定できます。ここでいうユニットとは、1分あたりにカゼインから放出されたチロシン相当量のマイクロモル数を指します。こんにちは、私はCarrie Cup Vineyardです。ミズーリ州セントルイスにあるSigma Aldridge DeKalb施設の研究員を務めております。本日は、Sigma Aldridgeにおけるプロテアーゼ活性の汎用的な試験方法をご紹介します。当社の品質管理部門では主にこのアッセイを用いて、お客様の研究室に直接出荷する前に、プロテアーゼに十分な活性があることを確認しています。アッセイを開始する前に、以下の試薬が正しく調製されていることを確認する必要があります。50 millimolar リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）を用意します。使用前に溶液を37 °Cに設定します。6.5 mg/mLの濃度で1 L調製した0.65% (w/v) カゼイン溶液を用います。緩やかに撹拌しながら溶液温度を徐々に上昇させ、均一な分散状態になるまで80〜85 °Cで約10分間保持します。溶液を沸騰させないことが非常に重要です。その後、必要に応じて水酸化ナトリウムと塩酸でpHを調整します。6.1 Nのストック溶液を精製水で1対55の比率で希釈して調製した110 mMのトリクロロ酢酸溶液、0.5 mMのフォールマン・マイヤー試薬またはフォールマン・フェノール試薬を用います。この試薬がチロシンと反応し、測定可能な色変化を生じさせます。これはプロテアーゼの活性に直接的に関連します。精製水を用いて無水炭酸ナトリウムを53 mg/mLで調製した500 mM炭酸ナトリウム溶液と、10 mM酢酸ナトリウム緩衝液に5 mMカルシウムを加え、pH 7.5、37 °Cに調整した酵素希釈液を用意します。これらの溶液を、固体のプロテアーゼサンプルの溶解や、酵素溶液の希釈に使用します。L tyrosine標準ストック溶液（初期濃度1.1 millimolar、L tyrosineを0.2 milligram/mLの濃度で溶解させた溶液）を精製水で調製し、tyrosineが溶解するまで緩やかに加熱します。カゼインと同様に、この溶液を沸騰させないでください。L tyrosine標準溶液を室温まで冷却させます。必要に応じて、この溶液をさらに希釈して標準曲線を作成します。あらかじめ活性が決定されている固体プロテアーゼ試料を、酵素希釈液を用いて 0.1 から 0.2 units/mL に溶解します。この溶液は、品質管理アッセイの陽性対照として、また酵素活性を決定するために行う計算のバリデーションとして使用します。試薬の調製が完了し、すべて適切な温度になったので、プロテアーゼアッセイを開始します。このアッセイを開始するには、約 15 milliliters を収容できる適切なバイアルを用意します。テストする各酵素につき、4 本のバイアルが必要です。1 本のバイアルをブランクとして使用し、残りの 3 本を 3 つの Activity のアッセイに使用します。プロテアーゼの3段階希釈は、最終計算の相互照合を行う際に有用です。4本のバイアルそれぞれに0.65%カゼイン溶液を5 mLずつ分注し、37 °Cの水槽で約5分間平衡化させます。次に、ブランク以外の3本の試験サンプルバイアルに、異なる濃度の酵素溶液を加えます。渦巻き状に混ぜて混合し、37 °Cで正確に10分間インキュベートします。このインキュベーション時間中のプロテアーゼ活性と、それに伴うチロシンの遊離量を測定し、テストサンプル間で比較します。10分間のインキュベーション後、各チューブに5 mLのTCA試薬を加えます。次に、ブランクを含む各チューブに適切な量の酵素溶液を加え、各チューブ内の酵素溶液の最終容量を1 mLにします。これは、酵素自体の吸光度を補正するために行います。次に、溶液を30 °Cで30分間インキュベートします。この30分間のインキュベーションの間に、6本のDRバイアルを用いてチロシン標準液の希釈系列を準備してください。これにより、6本のバイアルにそれぞれ8mLまで容易に入れることができます。1.1mMのチロシン標準ストック溶液を、0.05、0.1、0.2、0.4、および0.5mLの各量で添加します。ブランクにはチロシン標準溶液を添加しないでください。色の変化が少ないことが予想されるIPUテストサンプルには、より低濃度の標準液が必要になる場合があります。チロシン標準溶液を添加した後、各標準液に精製水を適量加え、全量を2 mLにします。インキュベーション後、各テスト溶液およびブランクをろ過します。0.45 µmのシリンジフィルターを用いて、2 mLのテストサンプルおよびブランクろ液を、少なくとも8 mLの容量を持つ4本のDRバイアルに加えます。標準物質および標準ブランクを調製した際と同じ種類のバイアルを使用できます。標準物質および標準ブランクを含むすべてのバイアルに5 mLの炭酸ナトリウムを加え、最良の結果を得るために、直後にサリン試薬を加えます。同様に、テストサンプルおよびテストブランクにも炭酸ナトリウムを加えます。炭酸ナトリウムの添加後、これらの溶液が濁ることに気づくはずです。次に、遊離チロシンと反応させるために、沈殿試薬を加えます。その後、DRAMバイアルを旋回させて混合し、37 °Cで30分間インキュベートします。標準試料では、添加したチロシンの量に相関して色のグラデーションが現れ、チロシン濃度が最も高いものが最も濃い色になることが確認できます。また、テストサンプルに顕著な色の変化が見られることがわかります。これらの溶液2 mLを、0.45 µmのシリンジフィルターを用いてろ過し、適切なキュベットに移します。これでアッセイが完了しましたので、分光光度計を用いて吸光度を測定します。サンプルの吸光度は、分光光度計を用いて波長660 nmで測定します。光路長を1 cmに設定し、標準試料、標準ブランク、各検体サンプル、および検体ブランクの吸光値を記録します。すべてのデータが収集されたら、標準曲線の作成に移ります。標準液と標準ブランクの吸光度の差を算出し、検量線を作成する必要があります。この差は、標準液中のチロシン量に起因する吸光度値となります。この単純な計算の後、5つの標準液それぞれについて、X軸にマイクロモル単位の量、Y軸に吸光度の変化をプロットし、標準曲線を作成します。データポイントを入力して最良適合線を作成した後、テストサンプルの吸光度とテストブランクの吸光度の差を算出することで、テストサンプルにおける吸光度の変化を求めます。標準曲線を参照し、Y軸上でテストサンプルのいずれかの吸光度値を特定します。次に、X軸に平行に線を惹き、標準曲線と交差する点まで移動させます。次に、この時点で得られたX座標から、この特定のタンパク質分解反応中に遊離したチロシンの量およびマイクロモル数を算出します。1ミリリットルあたりのユニット数で酵素活性を求めるには、以下の計算を行います。まず、標準曲線から得られた遊離チロシン当量マイクロモル数に、アッセイの全量（本例では11 milliliters）を掛け合わせます。その後、この値をさらに他の3つの数値で除します。アッセイ時間は10分間とし、アッセイに使用する酵素量については変動させます。ここでは1 mLを使用することにします。比色検出に使用するmL単位の容量は、使用するQ-cubeによって異なる場合があります。2 mLを使用します。チロシンのマイクロモル数を分単位の時間で除することで、ユニットと呼ぶプロテアーゼ活性の測定値が得られます。分子と分母の体積測定単位を相殺させることで、1 mLあたりのユニットという酵素活性の測定値が残ります。酵素希釈液で希釈した固体プロテアーゼ試料中の活性を決定するために、1 mLあたりのユニット数で表される活性を、本アッセイで元々使用した固体の濃度（mg/mL）で除算し、1 mgあたりのユニット数としての活性を算出します。以上で、Sigma社のユニバーサルプロテアーゼ活性アッセイを用いたプロテアーゼ活性の分析方法について説明しました。本手順を実施する際に確認された通り、カゼイン溶液とチロシン溶液の両方をゆっくりと加熱し、沸騰させないことが極めて重要です。また、標準物質用と各テストサンプル用の両方に対して、それぞれ異なるブランクを用意することが極めて重要です。以上になります。ご視聴ありがとうございました。プロテアーゼ活性の測定がうまくいくことを願っております。

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