シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

プロテアーゼは、実験室においてペプチド結合を分解します。プロテアーゼの活性を測定、あるいは比較することがしばしば必要となります。Sigma社のユニバーサル・プロテアーゼ活性測定法は、プロテアーゼ活性を決定するための標準的な手順として利用でき、これは当社の品質管理手順においても実施されています。

本アッセイでは、テスト対象のプロテアーゼがカゼインを消化する際の基質としてカゼインが機能します。これにより、他のアミノ酸やペプチド断片とともにアミノ酸のチロシンが遊離します。遊離したチロシンがフォールマン・シールカルल्शियमフェノールまたはフォールマン試薬と反応して青色の発色団を生成し、これを分光光度計を用いて吸光度として定量・測定します。

カゼインから放出されるチロシンの量が多いほど、より多くの発色団が生成され、プロテアーゼの活性が強くなります。プロテアーゼの活性によって生成された吸光度値は、既知量のチロシンをFC試薬と反応させて吸光度の変化を相関させた標準曲線と比較されます。標準曲線から得られたマイクロモル単位のチロシン量に基づき、プロテアーゼサンプルの活性をユニット単位で決定できます。ここでいうユニットとは、1分あたりにカゼインから放出されたチロシン相当量のマイクロモル数を指します。こんにちは、私はCarrie Cup Vineyardです。ミズーリ州セントルイスにあるSigma Aldridge DeKalb施設の研究員を務めております。

本日は、Sigma Aldridgeにおけるプロテアーゼ活性の汎用的な試験方法をご紹介します。当社の品質管理部門では主にこのアッセイを用いて、お客様の研究室に直接出荷する前に、プロテアーゼに十分な活性があることを確認しています。アッセイを開始する前に、以下の試薬が正しく調製されていることを確認する必要があります。

50 millimolar リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）を用意します。使用前に溶液を37 °Cに設定します。6.5 mg/mLの濃度で1 L調製した0.65% (w/v) カゼイン溶液を用います。緩やかに撹拌しながら溶液温度を徐々に上昇させ、均一な分散状態になるまで80〜85 °Cで約10分間保持します。

溶液を沸騰させないことが非常に重要です。その後、必要に応じて水酸化ナトリウムと塩酸でpHを調整します。6.1 Nのストック溶液を精製水で1対55の比率で希釈して調製した110 mMのトリクロロ酢酸溶液、0.5 mMのフォールマン・マイヤー試薬またはフォールマン・フェノール試薬を用います。この試薬がチロシンと反応し、測定可能な色変化を生じさせます。

これはプロテアーゼの活性に直接的に関連します。精製水を用いて無水炭酸ナトリウムを53 mg/mLで調製した500 mM炭酸ナトリウム溶液と、10 mM酢酸ナトリウム緩衝液に5 mMカルシウムを加え、pH 7.5、37 °Cに調整した酵素希釈液を用意します。これらの溶液を、固体のプロテアーゼサンプルの溶解や、酵素溶液の希釈に使用します。

L tyrosine標準ストック溶液（初期濃度1.1 millimolar、L tyrosineを0.2 milligram/mLの濃度で溶解させた溶液）を精製水で調製し、tyrosineが溶解するまで緩やかに加熱します。カゼインと同様に、この溶液を沸騰させないでください。L tyrosine標準溶液を室温まで冷却させます。

必要に応じて、この溶液をさらに希釈して標準曲線を作成します。あらかじめ活性が決定されている固体プロテアーゼ試料を、酵素希釈液を用いて 0.1 から 0.2 units/mL に溶解します。この溶液は、品質管理アッセイの陽性対照として、また酵素活性を決定するために行う計算のバリデーションとして使用します。試薬の調製が完了し、すべて適切な温度になったので、プロテアーゼアッセイを開始します。

このアッセイを開始するには、約 15 milliliters を収容できる適切なバイアルを用意します。テストする各酵素につき、4 本のバイアルが必要です。1 本のバイアルをブランクとして使用し、残りの 3 本を 3 つの Activity のアッセイに使用します。

プロテアーゼの3段階希釈は、最終計算の相互照合を行う際に有用です。4本のバイアルそれぞれに0.65%カゼイン溶液を5 mLずつ分注し、37 °Cの水槽で約5分間平衡化させます。次に、ブランク以外の3本の試験サンプルバイアルに、異なる濃度の酵素溶液を加えます。渦巻き状に混ぜて混合し、37 °Cで正確に10分間インキュベートします。

このインキュベーション時間中のプロテアーゼ活性と、それに伴うチロシンの遊離量を測定し、テストサンプル間で比較します。10分間のインキュベーション後、各チューブに5 mLのTCA試薬を加えます。次に、ブランクを含む各チューブに適切な量の酵素溶液を加え、各チューブ内の酵素溶液の最終容量を1 mLにします。

これは、酵素自体の吸光度を補正するために行います。次に、溶液を30 °Cで30分間インキュベートします。この30分間のインキュベーションの間に、6本のDRバイアルを用いてチロシン標準液の希釈系列を準備してください。

これにより、6本のバイアルにそれぞれ8mLまで容易に入れることができます。1.1mMのチロシン標準ストック溶液を、0.05、0.1、0.2、0.4、および0.5mLの各量で添加します。ブランクにはチロシン標準溶液を添加しないでください。

色の変化が少ないことが予想されるIPUテストサンプルには、より低濃度の標準液が必要になる場合があります。チロシン標準溶液を添加した後、各標準液に精製水を適量加え、全量を2 mLにします。インキュベーション後、各テスト溶液およびブランクをろ過します。

0.45 µmのシリンジフィルターを用いて、2 mLのテストサンプルおよびブランクろ液を、少なくとも8 mLの容量を持つ4本のDRバイアルに加えます。標準物質および標準ブランクを調製した際と同じ種類のバイアルを使用できます。標準物質および標準ブランクを含むすべてのバイアルに5 mLの炭酸ナトリウムを加え、最良の結果を得るために、直後にサリン試薬を加えます。同様に、テストサンプルおよびテストブランクにも炭酸ナトリウムを加えます。炭酸ナトリウムの添加後、これらの溶液が濁ることに気づくはずです。

次に、遊離チロシンと反応させるために、沈殿試薬を加えます。その後、DRAMバイアルを旋回させて混合し、37 °Cで30分間インキュベートします。標準試料では、添加したチロシンの量に相関して色のグラデーションが現れ、チロシン濃度が最も高いものが最も濃い色になることが確認できます。

また、テストサンプルに顕著な色の変化が見られることがわかります。これらの溶液2 mLを、0.45 µmのシリンジフィルターを用いてろ過し、適切なキュベットに移します。これでアッセイが完了しましたので、分光光度計を用いて吸光度を測定します。

サンプルの吸光度は、分光光度計を用いて波長660 nmで測定します。光路長を1 cmに設定し、標準試料、標準ブランク、各検体サンプル、および検体ブランクの吸光値を記録します。すべてのデータが収集されたら、標準曲線の作成に移ります。

標準液と標準ブランクの吸光度の差を算出し、検量線を作成する必要があります。この差は、標準液中のチロシン量に起因する吸光度値となります。この単純な計算の後、5つの標準液それぞれについて、X軸にマイクロモル単位の量、Y軸に吸光度の変化をプロットし、標準曲線を作成します。

データポイントを入力して最良適合線を作成した後、テストサンプルの吸光度とテストブランクの吸光度の差を算出することで、テストサンプルにおける吸光度の変化を求めます。標準曲線を参照し、Y軸上でテストサンプルのいずれかの吸光度値を特定します。次に、X軸に平行に線を惹き、標準曲線と交差する点まで移動させます。

次に、この時点で得られたX座標から、この特定のタンパク質分解反応中に遊離したチロシンの量およびマイクロモル数を算出します。1ミリリットルあたりのユニット数で酵素活性を求めるには、以下の計算を行います。まず、標準曲線から得られた遊離チロシン当量マイクロモル数に、アッセイの全量（本例では11 milliliters）を掛け合わせます。その後、この値をさらに他の3つの数値で除します。

アッセイ時間は10分間とし、アッセイに使用する酵素量については変動させます。ここでは1 mLを使用することにします。比色検出に使用するmL単位の容量は、使用するQ-cubeによって異なる場合があります。

2 mLを使用します。チロシンのマイクロモル数を分単位の時間で除することで、ユニットと呼ぶプロテアーゼ活性の測定値が得られます。分子と分母の体積測定単位を相殺させることで、1 mLあたりのユニットという酵素活性の測定値が残ります。

酵素希釈液で希釈した固体プロテアーゼ試料中の活性を決定するために、1 mLあたりのユニット数で表される活性を、本アッセイで元々使用した固体の濃度（mg/mL）で除算し、1 mgあたりのユニット数としての活性を算出します。以上で、Sigma社のユニバーサルプロテアーゼ活性アッセイを用いたプロテアーゼ活性の分析方法について説明しました。本手順を実施する際に確認された通り、カゼイン溶液とチロシン溶液の両方をゆっくりと加熱し、沸騰させないことが極めて重要です。

また、標準物質用と各テストサンプル用の両方に対して、それぞれ異なるブランクを用意することが極めて重要です。以上になります。ご視聴ありがとうございました。プロテアーゼ活性の測定がうまくいくことを願っております。