分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Xenopus labiasの卵抽出物は、核の構築や核タンパク質の輸送といった細胞内イベントのin vitro再構成における、細胞質およびオルガネラ材料として有用です。精子のクロマチンDNAを粗抽出物または分画されたXUS卵抽出物のいずれかに添加すると、抽出物中に存在する膜小胞がクロマチン表面に結合して融合し、核膜孔成分を取り込むことで、完全に機能的な合成核を形成します。これにより、抽出物の免疫枯渇法やタンパク質の編集を通じて、これらのプロセスの分子基盤を特性評価することが可能になります。

こんにちは。私はマリー・クロスです。ジョージア州アトランタのエモリー大学細胞生物学部のモーリーン・パワー博士の研究室に所属する大学院生です。本日は、分画されたゼノプス卵抽出物を用いて、in vitroで核を形成する方法をご紹介します。この手順には、核構築反応の実施と、核形成の評価というステップが含まれます。

それでは始めましょう。核の再構成を開始するために、分画した細胞質の分注量を取り、0.2 Mのストック溶液からホスホクレアチンを最終濃度20 mMになるように加えます。次に、5 mg/mLのストック溶液からクレアチンキナーゼを最終濃度50 µg/mLになるように加えます。

最後に、0.2 Mのストック溶液を用いて、20 µMのATPを添加します。次に、1:10の希釈倍率で、細胞質に軽膜画分を添加します。これにより、元の粗抽出液に含まれる膜の量に近似させます。

ピペッティングによりすべての成分を混合し、抽出液中に膜を分散させます。この操作は、精子クロマチンを添加する前に行う必要があります。次に、所定の濃度の精子クロマチンを分画抽出液に加え、カットチップを用いて穏やかに上下にピペッティングし、抽出液と精子を直ちに混合します。

精子クロマチンを抽出液に添加すると、直ちに脱凝縮が始まり、その後凝縮して剪断を受けやすくなります。通常、これらの反応は、全量が100 microliters未満となるように500 microliter遠心チューブを用いて調製します。卵抽出液は、最大8,000から9,000までの形成を支持します。

1 µLあたりの核数を調整し、核を形成させるため、混合物を室温で1〜2時間インキュベートします。核は染色を用いて可視化します。約30分後、新たに形成された核は小さく楕円形になります。

DNAはまだかなり凝縮されており、UVチャンネルで観察すると、DNAが凝縮するにつれて核はフックスピンによる均一な淡い青色に見えるはずです。さらに、青色の染色は均一ではなくなり、最終的に黒い隙間が現れます。核膜の形成は、固定液に1 µg/maleの3,3'-ジアミノベンジジン（DHCC）を添加することで可視化できます。

DHCCはフルオレセインチャンネルで可視化される蛍光性親油性染料です。核形成の初期段階では、膜小胞がクロマチン表面に結合し、斑状に融合し始めます。これにより、形成されつつある膜が不均一で不連続な外観を示します。

膜が完成すると、核の表面で平滑化し、DNAの周囲に均一で途切れのない縁として現れます。核に取り込まれなかった膜小胞があるため、周囲の細胞質にはかなりのバックグラウンド蛍光が見られます。以上で、アフリカツメガエル卵抽出物の可溶性画分および軽膜画分を用いたin vitroでの核再構成について説明しました。

粗抽出物は核アセンブリに使用できますが、凍結融解後は使用できないことに注意してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りします。