Name: 体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶレーザーピンセットを用いた体外培養神経細胞の操作法。光学トラップで細胞を捕捉・移動させ、神経科学や細胞生物学研究における細胞挙動の理解に応用する技術を解説する。

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研究は、NIHの助成金EY012031とEY0182175とFMカービー財団によってサポートされていました。

文化の中で分離した細胞を操作するための光ピンセット 光ピンセットの捕捉力は光の運動量（; Ashkinら、1986。Ashkin、1991）から生成されます。これらの力は容易に懸濁液中の細胞をトラップが、それらは表面に付着する細胞を移動することはできません。したがって、細胞がトラップされている時点で培養皿への付着を減らすために、カバースリップは、撥のセルを持つポリ-2 -ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ- HEMA）（シグマケミカル社、セントルイス、MO）、毒性のない化合物で被覆されているプロパティは、以前に内皮細胞上の接着試験（フォークマンとモスコーナ、1978）に採用。ポリ- HEMAが培養皿の半分をカバーしながら、残りの半分は、細胞の成長をサポートしている基質でコーティングされています。当研究室では、サル- 1は培養サンショウウオ網膜細胞の基質として使用されます。サル- 1とポリ- HEMAコートディッシュを製造するための手順を以下に示します。 培養皿の作製<ol><li>酸のクリーンcoverglasses（＃1 VWRサイエンティフィック社、メディア、PA）。このカバーガラスは、レーザーを集束させるために必要な高開口数の目的のために必要なだけ0.1mmのその厚さ、のために選ばれました。 </li><li>細胞の撥領域を作成するには、室温で一晩95％エタノール1mlの20 mgのポリ- HEMA（シグマケミカル社、セントルイス、MO）を溶解する。好ましくは、このソリューションは、準備の1ヶ月以内に使用する必要があります。 </li><li>このようなボンネットのようなほこりのない環境で近くに垂直位置にcoverglassesを支える。 </li><li> 200μlのマイクロピペットのプラスチック製の先端からカバーガラスの上部付近にポリ- HEMAの解決方法の1つまたは2滴を置きます。ドロップは（各50 -100μlの約）カバーガラスの半分に制限する必要があります。急な傾斜は、ポリ- HEMAの薄いにもコーティングを提供し、底にカバーガラスの表面下に液体の流れを保証します。ポリ- HEMAコートしたcoverglassesは、室温で30-60分間フード内で乾燥することができます。 </li><li>エッジに近い微細な先端のペンでカバーガラスのポリHEMA側をマーク。 </li><li> 35mmの培養皿の底に1cmの穴を開けます。 </li><li>ポリ- HEMAコーティング面が皿の内側に向かって手前になるように、Sylgard 184（ダウコーニング社、ミッドランド、MI）と培養皿の底に接着剤ポリ- HEMAコートしたカバーガラスを。ポリ- HEMAコーティングの端が穴の中央を下に実行されることを確認します。料理は、ほこりのない環境で、室温で1〜3日間乾燥することができます。 </li><li>ポリ- HEMAコーティングのエッジに続くダイヤモンドペンでカバーガラスの外側の線に傷を付けない。その後、離れてそれを約2mmに直角に二つの交差する線に傷を付けない。交差点の二点は、参照または顕微鏡のステージ上で培養皿の同じ方向を再現するために使用する基準点として機能します。 </li><li>一晩紫外光の下で料理を滅菌する。 </li><li>網膜細胞膜（気前よくピーターMacLeish、医学のモアハウススクールが提供するに対して発生させたマウス抗サンショウウオの抗体を含む培養皿の細胞付着性半分、コートサル- 1と非ポリHEMA半分を、作成するには、アトランタ、ジョージア州、。）MacLeishら（1983）を参照してください。ポリ- HEMA側上で液体をこぼさないように注意しながら、約100μlの0.1 mg / mlの滅菌ヤギ抗マウスIgG抗体（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）の、と最初に、コートサル- 1側を。三時間のために残し、それを取り外します。一度か二度、次に皿のポリ- HEMA側に液体をこぼさないように注意しながら、100μlのサル- 1上清を置く滅菌リンゲル液と同じ部分を洗う。第一抗体はサル- 1は、既知の濃度で塗布されることが保証されます。 </li><li>サル- 1晩で皿をインキュベートする。 </li><li>サル- 1抗体溶液を除去し、滅菌リンゲル液で領域を洗う。細胞播種直前に皿に2mlの培地をご紹介。 </li></ol>両生類リンゲル溶液、無血清培地両生類、および酵素消化のためのリンゲル液の組成はMacLeishとタウンズ - アンダーソン（1988）とマンデルらに記載されています。 （1993）。 細胞培養の準備このビデオで使用されている細胞が由来した明順応、成人、水生相虎サンショウウオは（Ambystoma tigrinum）、長さが17〜22センチメートルを測定する（チャールズサリバン社、ナッシュビル、テネシー州）、5℃に維持Cを上12時間：12時間明暗サイクル。プロトコルは、動物実験によって承認され、国立衛生研究所からのガイドラインに厳密に従い、ニュージャージー医科歯科大学の委員会（IACUC）を使用していた。網膜細胞培養を調製するための手順は、Nachman - Clewnerとタウンズ - アンダーソン（1996）によって記述され、次のとおりですされています。 <ol><li>首を切ると髄動物。目を削除し、角膜と虹彩をばらばらにする。網膜は、アイカップの中でわずかにデタッチしてください。網膜の下に湾曲した鉗子を置くことによって、網膜をかき出す。レンズはこの段階で網膜に接続されている場合、それは重要ではありません。 </li><li> 40分のためのサンショウウオリンゲル溶液に14 U / mlのパパイン（ワーシントン、フリーホールド、ニュージャージー州）で網膜を消化。 </li><li>使用前に、パパインリンゲル溶液を30分間95％O 2 / 5％CO 2ガスをバブリングしてください。、その後0.22ミクロンフィルター（ミリポア、Carrigtwohill、アイルランド）を通過させることによって滅菌。 </li><li>無菌サンショウウオリンゲル液で3回網膜をすすぎます。 </li><li>リンゲル溶液からレンズをはずして、その後静かに細胞懸濁液を得るためにピペットを退屈さ3ミリメートルと網膜組織をひいて粉にする。 </li></ol>分離されたニューロンのレーザーピンセット操作<ol><li>ステージ上の基準点と皿にマークを合わせて料理を向ける、顕微鏡のステージ上に培養皿を置きます。コンピュータの基準点の座標を保存します。 </li><li>料理のサル- 1とポリ- HEMA半分の両方の上に細胞をプレート。 </li><li>細胞がディッシュの接着側の細胞が抗体を基板に接続するための十分な長さは約20分、のために解決することができます。 </li><li>料理のサル- 1接着側のセルを選択します。 xとyのステージは、細胞に近い位置の座標をマーク。私たちのケースでは、ポイントは選択されたセルの一次樹状突起から約10μmのだ。コンピュータの座標を保存します。 </li><li>皿のポリ- HEMA側の私たちの例では、第2ニューロン、感光体を、選択して、それをトラップするために、レーザーピンセットのツールを使用してください。トラッピングは、パワーレベルの広い範囲で達成することができます。しかし、我々はセルと一緒にトラッピング破片を防ぐのに十分な低さが、メディアを介して細胞を輸送するのに十分である、10％-20％で、レーザーのパワーを設定します。 </li><li>トラップ内のセルを保持しながら、細胞がウェル培養皿の表面上および接続されているすべてのニューロン上になるように段階を下げる。サル- 1側で以前に保存されたx座標およびy座標にセルを持って来るために、コンピュータの制御下にステージを移動します。ステージ移動は、8 -20μmの/ sの速度で設定されていましたが、最高速度は、経験的に決定されるべきである。サル- 1側の宛先ポイントに到着、皿の表面にトラップされた細胞を持ってステージを上げる。セルの配置は、数ミクロンの精度で行うことができます。細胞は、サル- 1基質に付着することができます。 </li><li>ペア形成の前と後のペアの両方の細胞のデジタル画像を得ることが有用な記録を提供します。 </li><li>インキュベーターで細胞のペアを維持する。サンショウウオの細胞の場合は、10時、加湿チャンバーに料理を置く℃に細胞は、ビデオの時間の経過によって監視し、必要な細胞生物学的なテクニックを使用することができます。 </li></ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+Single-Beam+Gradient+Force+Optical+Trap+for+Dielectric+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles.</a> Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).</li>
<li>Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+cells+have+different+target+preferences+in+vitro+as+revealed+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vision%22%5BJournal%5D)">Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers.</a> Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+localized+cell+heating+induced+by+infrared+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).</li>
<li>MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).</li>
<li>MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synapse+formation+among+major+classes+of+adult+salamander+retinal+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro.</a> Neuron. 1, 751-760 (1988).</li>
<li>Mandell, J. W., MacLeish, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Townes-Anderson+E.+Process+outgrowth+and+synaptic+varicosity+formation+by+adult+photoreceptors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro.</a> J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).</li>
<li>Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-induced+remodelling+and+regeneration+of+the+ribbon+presynaptic+terminal+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro.</a> J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).</li>
<li>Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+retinal+neurons+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis.%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers.</a> Mol. Vis.. 4, (1998).</li>
</ol>

光は勢いがあり、それがセルを通過する光線が屈折されるとき、力が運動量の方向を変更する必要があります。のため運動量保存の法則から、反対方向の力は、順番に、セルに戻って反応する必要があります。 Ashkin（1991）顕微鏡対物レンズで集光レーザービームによって発生する力がフォーカスの中心に向かってセルを移動することを示した。レーザービームは、力のほんの数ピコニュートンを生成するにもかかわらず、この力は、媒体を介して細胞を引くのに十分です。難水溶によって吸収される近赤外波長は、細胞（Liuら1995）への損傷を回避するために使用されます。我々の研究室で使用されているレーザーピンセットのワークステーションは、（セルロボティクス株式会社、アルバカーキ）1 W、980nm波長の連続波のダイオードレーザーを使用しています。レーザー光は顕微鏡と同じ焦点面に光を当て、高開口数の40倍の油浸計画neofluorの対物レンズ（NA1.3）（カールツァイス社）を介して細胞に伝達される。 レーザーピンセット制御マイクロマニピュレーションは、ランダムに播種した細胞の研究に比べて多くの利点を示す。例えば、細胞は、すべて操作された細胞のために標準化することができますお互いから所望の距離に配置す...

<table><tbody><tr><td>25mm 円形 No.1 カバーガラス</td><td>VWR international</td><td>48380 080</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート (poly-HEMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3932</td><td>95% エタノールに溶解</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG 抗体</td><td>Chemicon International</td><td>AP181</td><td> 1mg/1ml、使用時に10倍に希釈</td></tr><tr><td>マウス抗サンショウウオ抗体を含む Sal-1 上清</td><td>Dr. Peter MacLeishより提供</td><td></td><td>Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA</td></tr><tr><td>内径 3 mm 5ml パイレックス使い捨てピペット</td><td>Corning</td><td>7078A-5</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ 35mm x 10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマーキット</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光ピンセット-マイクロツールまたはレーザーピンセット</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>波長 980nm 1 W 連続波ダイオードレーザー</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 倒立光顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 油浸 Plan-Neofluor 対物レンズ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>開口数 (N.A. 1.3)</td></tr><tr><td>白黒 CCD カメラ</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピュータおよびソフトウェア付きジョイスティック</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td>電動ステージ制御用</td></tr></tbody></table>

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

この論文とビデオでは、我々はin vitroでの成人網膜神経細胞の再生細胞プロセスのターゲット設定を研究する我々の研究室で使用されるプロトコルについて説明します。網膜細胞培養を調製するための手順は、解剖、網膜の消化と粉砕し、特にレーザーピンセットで使用するために作った料理で分離された網膜細胞のメッキと終わりで始まり。これらの料理は、細胞の接着剤の半分と細胞の撥半分に分かれています。細胞の接着面は、私たちの細胞が増殖する際に基板を提供するサル- 1抗体、の層でコーティングされています。他の接着剤基材は、他の細胞型を使用することができる。細胞の撥側は、ポリ- HEMAの薄層で被覆されている。皿のポリ- HEMA側に播種した細胞は、レーザーピンセットでトラップ運ばれ、ペアを作成するにはSAL - 1側のセルに隣接して配置されています。任意のサイズの細胞群の形成は、この手法で可能なはずです。 &quot;レーザーピンセット制御マイクロマニピュレーションは、&quot;研究者は細胞が移動するかを選択できることを意味し、そして細胞間の所望の距離は、標準化することができる。レーザービームは、培養皿の透明な表面を通過するので、セルの選択と配置は、同封の、無菌環境で行われます。細胞は、ビデオタイムラプスによって監視し、必要な細胞生物学的なテクニックを使用することができます。この手法は、細胞間相互作用の調査を助けるかもしれない。

このビデオでは、in vitroでレーザーピンセットを用いた培養神経細胞の操作を説明します。

本論文およびビデオでは、成人の...の再生細胞突起の標的指向性の好みを研究するために、当研究室で用いられているプロトコルについて解説します。

Ashkinは、レーザーピンセット（光トラップ）が微小化された生体試料を操作するための強力なツールであることを最初に示しました。このビデオでは、この技術を応用してニューロンを捕捉し、移動させる方法について解説します。こちらが光ピンセットワークステーションです。緑色の矢印は、顕微鏡の光学系を通過するレーザービームの経路を示しています。顕微鏡の対物レンズによって集光されたレーザービームが細胞で屈折すると、光線の方向を変える力が細胞に作用し、細胞を焦点の中心に向かって移動させます。これにより、細胞を培地中で牽引するのに十分なピコニュートン（pN）単位の力が生成されます。このビデオでは、ディッシュの作製、網膜細胞の調製、培養ディッシュへの細胞播種、レーザーツィーザーによる操作、および細胞増殖の観察について説明します。細胞はガラスに付着するため、ツイーザーで細胞を容易に捕捉できるよう、細胞排斥領域を作成する必要がありました。ディッシュの半分には、細胞忌避性ポリマーであるpoly hemaがコーティングされています。もう半分には、細胞の増殖を支持する基質であるcell oneがコーティングされています。まず、ディッシュの細胞接着側に存在する細胞を特定します。次に、もう一つの細胞をポリマー側にトラップし、接着側へと輸送して、2つの細胞をペアにします。ディッシュを準備するために、ダスト除去済みの滅菌済みPolystar社製35 mm培養ディッシュを使用します。まず、小型旋盤またはボール盤を用いて、底面に1 cmの穴を開けます。酸洗浄したカバーガラスを取り出し、フード内などのクリーンベンチに直立させて配置します。95%エタノールに溶解したpolyus溶液を取り、カバーガラスの上端付近の片側にのみ数滴滴下します。polyhemaを乾燥させます。カバーガラスのpolyus側をマークします。培養皿の底にある穴の周囲にSガードを配置します。Sガードを用いてカバーガラスを皿に接着します。ポリアミドが内側にあることを確認し、またシルガードの隙間から漏れがないことを確認してください。カバーガラスを、poly hemaコートの端がディッシュの中央に沿うように配置します。ディッシュを2〜3日間乾燥させた後、ダイヤモンドチップペンを用いてディッシュの底に印を付けます。この印は、顕微鏡ステージ上でディッシュを配置する際の基準点として使用します。ディッシュをフードの中に入れ、紫外線（UV）ライトで滅菌します。ディッシュのnon polyus側にヤギ抗US抗体溶液を1〜2滴滴下し、poly hemicコーティング上にこぼさないように注意して、約3時間放置します。これを拭き取り、滅菌リンゲル液で洗浄します。同じ領域にcell one抗体溶液を滴下し、翌日の実験に備えて一晩インキュベートします。当研究室で使用している細胞は、成体水棲期のサンショウウオの網膜に由来します。網膜を摘出して取り出し、酵素で消化します。その後、単離した細胞を培養皿に播種することができます。眼球を摘出します。角膜を解剖し、除去します。眼杯を滅菌リンガー液に入れます。湾曲したピンセットの端を用いて網膜をすくい出し、眼杯から分離させます。二酸化炭素と酸素をプロパンを含むリンガー液にバブリングし、その後、0.2 µmの超微細フィルターで滅菌します。網膜を酵素溶液に入れ、組織を分散させるために撹拌しながら約40分間消化させます。3回洗浄した後、網膜をtrypsinで分散させます。3 mmの球形ピペットを用いて、単離した細胞を播種準備状態にします。培地を含む培養皿を顕微鏡ステージに置き、皿底のスクラッチマークを使用して適切に方向を合わせます。これにより、後でディッシュの正確な位置を再現することが可能になります。その後、ディッシュのpoly hema側とcell one側の両方に細胞を播種します。顕微鏡ステージ上のディッシュの位置およびレーザー出力は、ジョイスティックで制御します。まず、ディッシュの片側に接着している細胞を特定します。これは、樹状突起によって識別可能な網膜多極細胞です。細胞の位置座標を保存します。これは、ディッシュのPolyus細胞反発剤塗布側にある桿体視細胞です。ディッシュを下げ、レーザーで細胞を捕捉してディッシュの底から持ち上げます。現在、細胞をディッシュの反対側にある多極細胞の座標まで輸送しています。実際には、細胞は静止しています。動いているのはディッシュの方です。細胞は現在、poly hemo コーティングの端を通過しています。細胞から伸びている突起が軸索末端です。細胞はディッシュ底部のデブリや他の細胞から十分に離れており、これらが細胞の移動を妨げる可能性があります。背景には、ディッシュ底部の細胞のデフォーカス画像が見えています。桿体細胞を多極細胞まで移動させ、その細胞から目的の地点および距離に正確に配置することができます。ディッシュを持ち上げると、細胞が細胞基質に接着します。この手法の主な利点は、移動させる細胞を選択できること、および密閉された無菌環境下で操作が行えることです。細胞間の相互作用は、ビデオタイムラプスまたはデジタル写真を用いてモニタリングすることができます。レーザーピンセットは、あらゆる生物学的手法と併用可能です。例えばここでは、蛍光技術を用いて、ピンセットで移動させた細胞間の接点にシナプスタンパク質が存在することを実証しています。

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JoVE Journal

Biology

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