体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

Ashkinは、レーザーピンセット（光トラップ）が微小化された生体試料を操作するための強力なツールであることを最初に示しました。このビデオでは、この技術を応用してニューロンを捕捉し、移動させる方法について解説します。こちらが光ピンセットワークステーションです。

緑色の矢印は、顕微鏡の光学系を通過するレーザービームの経路を示しています。顕微鏡の対物レンズによって集光されたレーザービームが細胞で屈折すると、光線の方向を変える力が細胞に作用し、細胞を焦点の中心に向かって移動させます。

これにより、細胞を培地中で牽引するのに十分なピコニュートン（pN）単位の力が生成されます。このビデオでは、ディッシュの作製、網膜細胞の調製、培養ディッシュへの細胞播種、レーザーツィーザーによる操作、および細胞増殖の観察について説明します。細胞はガラスに付着するため、ツイーザーで細胞を容易に捕捉できるよう、細胞排斥領域を作成する必要がありました。

ディッシュの半分には、細胞忌避性ポリマーであるpoly hemaがコーティングされています。もう半分には、細胞の増殖を支持する基質であるcell oneがコーティングされています。まず、ディッシュの細胞接着側に存在する細胞を特定します。

次に、もう一つの細胞をポリマー側にトラップし、接着側へと輸送して、2つの細胞をペアにします。ディッシュを準備するために、ダスト除去済みの滅菌済みPolystar社製35 mm培養ディッシュを使用します。まず、小型旋盤またはボール盤を用いて、底面に1 cmの穴を開けます。

酸洗浄したカバーガラスを取り出し、フード内などのクリーンベンチに直立させて配置します。95%エタノールに溶解したpolyus溶液を取り、カバーガラスの上端付近の片側にのみ数滴滴下します。polyhemaを乾燥させます。カバーガラスのpolyus側をマークします。

培養皿の底にある穴の周囲にSガードを配置します。Sガードを用いてカバーガラスを皿に接着します。ポリアミドが内側にあることを確認し、またシルガードの隙間から漏れがないことを確認してください。

カバーガラスを、poly hemaコートの端がディッシュの中央に沿うように配置します。ディッシュを2〜3日間乾燥させた後、ダイヤモンドチップペンを用いてディッシュの底に印を付けます。この印は、顕微鏡ステージ上でディッシュを配置する際の基準点として使用します。ディッシュをフードの中に入れ、紫外線（UV）ライトで滅菌します。

ディッシュのnon polyus側にヤギ抗US抗体溶液を1〜2滴滴下し、poly hemicコーティング上にこぼさないように注意して、約3時間放置します。これを拭き取り、滅菌リンゲル液で洗浄します。同じ領域にcell one抗体溶液を滴下し、翌日の実験に備えて一晩インキュベートします。

当研究室で使用している細胞は、成体水棲期のサンショウウオの網膜に由来します。網膜を摘出して取り出し、酵素で消化します。その後、単離した細胞を培養皿に播種することができます。

眼球を摘出します。角膜を解剖し、除去します。眼杯を滅菌リンガー液に入れます。

湾曲したピンセットの端を用いて網膜をすくい出し、眼杯から分離させます。二酸化炭素と酸素をプロパンを含むリンガー液にバブリングし、その後、0.2 µmの超微細フィルターで滅菌します。網膜を酵素溶液に入れ、組織を分散させるために撹拌しながら約40分間消化させます。

3回洗浄した後、網膜をtrypsinで分散させます。3 mmの球形ピペットを用いて、単離した細胞を播種準備状態にします。培地を含む培養皿を顕微鏡ステージに置き、皿底のスクラッチマークを使用して適切に方向を合わせます。

これにより、後でディッシュの正確な位置を再現することが可能になります。その後、ディッシュのpoly hema側とcell one側の両方に細胞を播種します。顕微鏡ステージ上のディッシュの位置およびレーザー出力は、ジョイスティックで制御します。

まず、ディッシュの片側に接着している細胞を特定します。これは、樹状突起によって識別可能な網膜多極細胞です。細胞の位置座標を保存します。

これは、ディッシュのPolyus細胞反発剤塗布側にある桿体視細胞です。ディッシュを下げ、レーザーで細胞を捕捉してディッシュの底から持ち上げます。現在、細胞をディッシュの反対側にある多極細胞の座標まで輸送しています。

実際には、細胞は静止しています。動いているのはディッシュの方です。細胞は現在、poly hemo コーティングの端を通過しています。

細胞から伸びている突起が軸索末端です。細胞はディッシュ底部のデブリや他の細胞から十分に離れており、これらが細胞の移動を妨げる可能性があります。背景には、ディッシュ底部の細胞のデフォーカス画像が見えています。

桿体細胞を多極細胞まで移動させ、その細胞から目的の地点および距離に正確に配置することができます。ディッシュを持ち上げると、細胞が細胞基質に接着します。この手法の主な利点は、移動させる細胞を選択できること、および密閉された無菌環境下で操作が行えることです。

細胞間の相互作用は、ビデオタイムラプスまたはデジタル写真を用いてモニタリングすることができます。レーザーピンセットは、あらゆる生物学的手法と併用可能です。例えばここでは、蛍光技術を用いて、ピンセットで移動させた細胞間の接点にシナプスタンパク質が存在することを実証しています。