Name: ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 学ぶルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで、貪食誘導された膜生合成関連遺伝子発現を解析する方法。Dual-Glo™システムを用いて、細胞機能の分子メカニズムを解明する。

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細胞の文化<ol><li>ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の保存培養は抗生物質のカクテル（ペニシリンのmlあたり100個および100μgを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で構成される&quot;中&quot;、で10cmの培養皿で増殖させるストレプトマイシン硫酸のml当たり）及び10％ウシ胎児血清（FBS）。 </li><li>実験用セルを設定するには、培地を吸引し、細胞をリン酸5mlで2回洗浄している生理食塩水（PBS）ソリューションをバッファ。 </li><li> PBSを除去し、0.25％トリプシンを含む溶液0.6 mLで置き換えられます。 </li><li>細胞がデタッチし始めているまで、皿を37˚Cで約2分間インキュベートする。 </li><li>培地5.5 mlのトリプシンを中和するために添加し、細胞を、血球計でカウントされます。 </li><li>細胞を、1ml当たり32万細胞に希釈し、ポリリジンコートした96穴培養プレートにウェルあたり0.1ミリリットルで分配される。 </li><li> 37˚C 8.8％CO2を含む大気中で組織培養インキュベーター中に皿を置き、24時間のために成長する。 </li></ol>トランスフェクション<ol><li>トランスフェクションのための準備では、実験条件とどのようなプラスミドの量はトランスフェクションされるごとに実行するかを多くの複製を考慮する必要があります。我々は日常的に三連のすべての条件を実行し、ウェルあたりのプラスミドDNAの50〜100 ngの合計をト​​ランスフェ。プラスミドミックスは、少なくとも記者はホタルルシフェラーゼと構成的プロモーターからの制御を発現するプラスミドウミシイタケルシフェラーゼを発現するコンストラクト含める必要があります。 </li><li>プラスミド溶液は1.5 mlのマイクロ遠心チューブにピペットと無血清および抗生物質を含まないDMEMのサンプルあたり10μLで補足されています。たとえば、20の井戸がそれぞれが50μgのDNAをトランスフェクトされる場合は、1μgのDNAに200μlのDMEMを加える。 </li><li> DMEM / DNA溶液に、μgのDNA当り3μlの&quot;トランジット293試薬&quot;（Mirus）を追加します。 ＆上下にピペッティングして混合し、少なくとも10分間室温で試料を放置する。 </li><li>この期間中、96ウェル培養プレートから培地を除去し、新鮮な培地Aの90μlのと交換してください</li><li>それぞれによくDMEM / DNA /トランジット293混合物の10μlを加える。 </li><li> 37˚C 8.8％CO2を含む大気中で組織培養インキュベーター中に皿を置き、24時間のために成長する。 </li></ol>貪食<ol><li>培地B（DMEMとHamのF12培地に加えて抗生物質の1:1混合物と10％FBS）を加えたml当たりゼロから1 mgで0.75μmのラテックスビーズを含む懸濁液を準備する。 </li><li> 96ウェル培養プレートからメディアを取り出して、培地Bのビーズ懸濁液0.1 mlを交換してください</li><li> 1000 × gで2分間プレートを回転させる</li><li>次に、細胞を6〜16時間、37˚Cで培養されています。条件とルシフェラーゼを駆動するために使用されるプロモーターに依存し、増加したレポーター遺伝子の発現は、1〜3時間後に検出することができます。 </li><li>同じケースではそれが30〜60分間ビーズで細胞をインキュベートするために必要となる場合があります、その後、PBSで2回洗浄には取り込まれなかったビーズを除去し、時間の追加の期間の細胞をインキュベートする前に新鮮な培地を追加することです。 </li></ol>デュアルGloTMルシフェラーゼアッセイ<ol><li>注：このキットを使用するための我々のプロトコルは、メーカーが推奨することからいくつかの点で異なります。これは、サンプルごとに必要な試薬の量を減らすために変更されています。 </li><li> -20˚Cで複数の小分けや店舗に1 M DTT、除算の溶液を調製します</li><li>の20mM Tris - HCl（pH7.8）中、10％（v / v）グリセロール、および0.5％（v / v）のトリトンX - 100を含む溶解バッファーを準備します。使用前に、一定量の実験に必要な量をと1xを0.5の最終濃度に1 M DTTを加えたプロテアーゼ阻害剤カクテルのmlあたり1μlを追加。残りのDTT溶液を再使用しないでください。 </li><li>初めてデュアルGloTMキットを使用する場合は、デュアルGloTMルシフェラーゼ基質（提供の一瓶に（キットに付属）デュアルGloTMルシフェラーゼバッファの一瓶の内容全体を転送することにより（ホタル）ルシフェラーゼ試薬を準備するキット付き）。 -20˚Cで10 mlのアリコートとストアに使用されていないルシフェラーゼ試薬を分ける</li><li>組織培養インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、氷の上に置きます。吸引によってメディアを削除する、40μlをウェルあたりの溶解バッファーを追加して、氷上で30分間プレートを残す。 </li><li>白、不透明な96ウェルプレート（OptiplateTM - 96、パーキンエルマーカタログ番号6005290）のアリコート15μlをウェルあたりのルシフェラーゼ試薬、およびその後細胞溶解液の15μLを追加で。 </li><li>室温で10分間プレートをインキュベートし、マイクロプレートリーダーで発光をお読みください。 </li><li>使用直前に、1部デュアルGloTMストップ＆グロを追加することにより、ウミシイタケルシフェラーゼの基質溶液の適当量を準備®、100部に試薬（キットに付属）デュアルGloTMストップ＆グロ®バッファー（キットに付属）。 </li><li>それぞれによく、10分間室温でインキュベートウミシイタケルシフェラーゼの基質溶液15μlのウェルあたりを、追加してから、再度発光を測定します。 </li></ol>

著者らに開示すべき事項はありません。

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

膜の生合成中に別の脂質合成経路の調整を検討するためには、膜の生合成は、迅速かつ誘導的に発生した実験システムで動作するように便利です。我々は、細胞が急速に粒子の貪食時の材料のラッピングとして失わ膜プールを補充するために膜脂質を合成としてラテックスビーズの貪食は、これらの目的のために実用的であることを見出した。ここでは、プロメガからデュアルグロルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アプローチと貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。

膜生合成における異なる脂質合成経路の協調性を研究するには、膜の...（以下、原文が続く）という実験系を用いることが有用である。

こんにちは、私は脂質合成の異なる経路が、記憶および生合成にどのように協調しているかを研究しているIL OVです。膜生合成が迅速に、かつ誘導的に起こる実験系があることは非常に有用です。ラテックスビーズの食作用は、そのような研究に特に有用であることが分かりました。なぜなら、細胞は取り込みプロセスの初期段階でラップ材として失われた膜を補充するために、非常に迅速に新しい膜を合成するからです。このビデオでは、同僚のOng Zangが、ルシフェラーゼベースのリポーターアッセイ法を用いて、食作用によって誘導される遺伝子発現の変化を研究するための手順を実演します。こんにちは、私はハーバード大学分子細胞生物学部のXです。今日は、リポーター遺伝子アッセイを用いて、食作用後の膜生合成に関与する遺伝子の調節を分析する方法について説明します。それでは、始めていきましょう。本手順では、ヒト胚性腎臓293細胞の培養物を使用します。これらの細胞は、10 cm培養皿を用い、10%胎児血清（FBS）および抗生物質カクテルを添加したBasal Modified Eagle's Medium（DMEM）である培地Aで培養します。標準化技術を用いて細胞を皿の底面から剥離して計数し、ポリリシンコートを施した96ウェルプレートに播種して、トランスフェクションを開始するまで24時間培養します。トランスフェクションにおいて、我々は通常、すべての条件を3連（triplicate）で実施し、1ウェルあたり合計50～100 ngのプラスミドDNAをトランスフェクションします。プラスミド混合物には、少なくともホタルルシフェラーゼを発現するレポーター構築物と、構成的プロモーターからレニラルシフェラーゼを発現するコントロールプラスミドを含める必要があります。まず、血清不含および抗生物質不含のDMEMにTransIT-2K3トランスフェクション試薬を混合した溶液を調製します。トランスフェクションを行うウェル1つにつき10 µLのDMEMを使用し、プラスミドDNA 1 µgあたり3 µLのTransIT-2K3試薬を添加してください。例えば、各20ウェルに50 nanogramのDNAをトランスフェクションする場合、200 µLのDMEMに3 µLのtrans 2 9 3試薬を加えます。この溶液をピペッティングで繰り返し混ぜ合わせ、室温で少なくとも5分間静置します。次に、DNAを個別のマイクロ遠心チューブに分注します。なお、使用するプラスミドストック溶液の濃度は、通常10〜100 nanogram/µLの間です。DM M 移行混合液を5分間インキュベートした後、DNAチューブに移し、ピペッティングによって溶液を再び混合します。次に、サンプルを室温で20分間静置させます。この20分間のインキュベーションの間に、96ウェル培養プレートから培地を取り除き、19 µL の新鮮な培地 A と交換します。インキュベーションが完了したら、D-M-M-D-N-A 翻訳混合液 10 µL を各ウェルに添加します。混合液は、既存の液体に直接ピペッティングしてください。ピペットチップがチューブの壁面に触れないように注意してください。また、未処理のまま検査に用いる細胞を3ウェル含めることが重要です。これらのウェルの平均ルシフェラーゼ活性を後でバックグラウンドとして差し引きます。96ウェルプレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、細胞を24時間培養します。24時間のインキュベーションが完了したら、膜生合成およびLaxビーズのバイオシスを誘導します。まず、細胞培養培地とLaxビーズを含む懸濁液を調製します。これを行うために、DMEMと、抗生物質および10% FBSを添加したF term mediumを1:1で混合したmedium Bを調製します。次に、最大1 mg/mLの濃度で0.75 µmのlatex beadsを添加します。当然ながら、すべての実験にはビーズを添加しないコントロールを含める必要があります。次に、96ウェル培養プレートから培地を除去し、各ウェルに100 µLのビーズ懸濁液を添加します。懸濁液を添加した後、プレートを1000 Gで2分間遠心分離します。これにより、ビーズをウェルの底に濃縮させ、食作用を促進させます。続いて、37 °Cで6～16時間、細胞による捕捉を行います。条件およびルシフェラーゼの発現を誘導するために使用するプロモーターによって、プロモーターの遺伝子発現は1〜3時間後に検出可能です。特定の実験では、例えば、粒子形成に影響を与えずに特定の薬剤が脂質合成に及ぼす影響を調べるために、falを脂質合成から切り離す必要がある場合があります。そのような場合は、細胞がビーズを細胞内に取り込む（サイトシス）時間を設けるため、ビーズと共に30〜60分間インキュベートしてください。このインキュベーション後、未結合のビーズを除去するために、PBSで細胞を2回洗浄します。その後、新鮮な培地を加え、レポーター遺伝子の発現のために6〜16時間インキュベートします。これで、フローアッセイに進む準備が整いました。Lucifer assaysを開始するために、20 mM Tris-HCl (pH 7.8)、10% (v/v) グリセロール、および 0.5% (v/v) Triton X-100を含むxisバッファーを、実験に必要な量だけ事前に調製します。次に、1 M DTTを 1 µL/mL の割合で添加します。使い残したDTT溶液は再利用しないでください。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを最終濃度0.5〜1倍になるように添加します。Dual-Gloキットを初めて使用する場合は、Dual-Gloルシフェラーゼバッファー1瓶の内容量すべてをDual-Gloルシフェラーゼ基質1瓶に移して、ホタルルシフェラーゼ試薬を調製します。未使用のルシフェラーゼ試薬を10 mLのチューブに分注し、-20°Cで保存します。ルシフェラーゼ試薬の準備が完了したら、組織培養インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、氷上に置きます。続いて、吸引によって培地を除去し、1ウェルあたり40 µLの溶解バッファーを加え、プレートを氷上で30分間静置します。次に、1ウェルあたり15 µLのルシフェラーゼ試薬を加えます。白い不透明な96ウェルプレート（ここではPerkinElmer OptiVueプレート96を使用）を用います。その後、15 µLの細胞溶解液を加え、室温で10分間インキュベートします。10分後、マイクロプレートリーダーでルミネッセンスを測定します。次に、コントロールプラスミドのデータを得るために、バニラルシフェラーゼアッセイを行います。この手順のため、Dual-Glo Stop &amp; Glo試薬を100部に対して1部の割合で加え、適切な量のルシフェラーゼ基質溶液を直前に調製してください。Dual-Glo Stop&amp;Glo バッファーを使用します。次に、各ウェルに基質溶液を 15 µL 加えます。プレートを室温で 10 分間インキュベートし、再度ルミネッセンスを測定します。これらのDual-Glo®フェリチンアッセイでは、メーカー推奨のプロトコルを変更したことにご注意ください。サンプルの必要試薬量を減らすため、プレートリーダーを用いてプレートを再解析することが可能です。マイクロプレートリーダーでデータを収集した後、さらなる解析のためにMicrosoft Excelなどのスプレッドシートプログラムにデータを転送できます。まず、未導入（unresected）の3つのウェルの平均値を算出し、各データポイントからその値を差し引きます。次に、各導入（transfected）ウェルにおいて、firefly luciferaseの値をルシフェラーゼの値で除します。その後、各3連サンプルのセットについて、平均値、標準偏差、および変動係数を算出します。本例では、x軸にプロットしたビーズの異なる濃度に対し、バニラルシフェラーゼに対するホタルルシフェラーゼの活性比をグラフ化しています。ご覧の通り、この比率には用量依存的な増加が見られます。以上で、ラテックスビーズの食作用に応答したLDL受容体プロモーターからの発現を測定するための、ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイの使用方法を説明しました。この手順を行う際は、トランスフェクション時の細胞のコンフルエンシーが80%から90%であることを確認することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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