ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

こんにちは、私はIL OVで、記憶と生合成のためのさまざまな脂質合成経路の調整を研究しています。膜の生合成が急速に起こり、誘導する実験系があることは有用です。ラテックスビートの食作用は、細胞が非常に迅速に新しい膜を合成して、巻き込みプロセスの早い段階で包装材料として失われた膜を補充するため、このような研究に特に有用であることがわかりました。

このビデオでは、同僚のOng Zangが、ハーバード大学の分子学部と細胞生物学のエクソンノースを活用して、Iルシフェラーゼベースのレポートアッセイアプローチを使用して、食作用誘発性遺伝子発現の変化を研究するために使用された手順を示します。今日は、レポート遺伝子アッセイを使用して、食作用後の膜生合成に関与する遺伝子の制御を分析する方法を紹介します。それでは、始めましょう。

この手順では、ヒト胚性腎臓2 93細胞の培養物を使用します。これらの細胞は、ベール、改変ワシ、エゴ、培地、またはDMMに10%胎児B血清またはFBSを補充し、抗生物質のカクテルからなる培地Aの10センチメートル培養皿で増殖します。標準化技術を用いて、細胞を皿の底から取り除き、対比した後、ポリリジンでコーティングした96ウェルプレートに播種し、取引開始まで24時間増殖させます。

私たちのトランスフェクトでは、すべての条件をトリプリケートとトランスフェクトで定期的に実行し、ウェルあたり合計50〜100ナノグラムのプラスミドDNAを実行します。格子縞混合物は、少なくともホタルルシフェラーゼを発現するレポーターコンストラクトおよび構成的プロモーターからの腎ルシファーを発現するコントロールプラスミドを含むべきである。まず、血清フレームと抗生物質フレームのDM EMとtrans two N 3トランスフェクション試薬の混合物を準備し、トランスフェクションする各ウェルに10マイクロリットルのDMMを使用し、プラスミドDNAのマイクログラムあたり3マイクロリットルのトランス2 9 3試薬を使用します。

例えば、各20ウェルに50ナノグラムのDNAを3マイクロリットルのトランス2 9 3試薬で200マイクロリットルのDM EMにトランスフェクトするとします。溶液をピペッティングで上下に繰り返して混合し、室温で少なくとも5分間放置します。次に、DNAを別々のマイクロ遠心チューブにパイプで移します。当社のプラスメーターストック溶液の濃度は、通常、マイクロリットルあたり10〜100ナノグラムです。

DM Mトランジット混合物を5分間インキュベートした後、DNAチューブに移し、溶液をピペッティングで再度混合します。その後、サンプルを室温で20分間放置します。20分間の挿管中に、96ウェブ培養プレートから培地を取り出し、10マイクロリットルのD-M-M-D-N-Aでインキュベーションが完了したら、19マイクロリットルの新鮮な培地Aと交換します。

混合物は、既存の液体に直接ピペットで移す必要があります。ピペットの先端がチューブの壁に触れないようにしてください。また、検査せずに放置する細胞のウェルを3つ含めることも重要です。

このウェルの平均ルシフェラーゼ活性は、バックグラウンドが96ウェルプレートを37°Cインキュベーターに配置し、細胞を24時間増殖させるときに後で差し引かれます。24時間のインキュベーションが完了したら、膜生合成の誘導、緩いビーズの生合成を進めます。まず、細胞培養培地と緩いビーズを含む懸濁液を調製します。

これを行うには、DM EMと麻、Fターム培地、抗生物質、および10%FBSの1対1の混合物である培地Bを準備します。次に、0.75ミクロンの緩いビーズで、1ミリグラムあたり1ミリグラムまでの濃度でビーズを添加します。もちろん、すべての実験には、ビーズが追加されていないコントロールを含める必要があります。

次に、96ウェル培養プレートから培地を取り出し、各ウェルを100マイクロリットルのビーズ懸濁液と交換します。懸濁液を添加したら、プレートを1000 Gで2分間回転させます。これにより、ウェルの底にビーズが濃縮され、食作用が容易になります。次に、細胞を37°Cで6〜16時間捕捉します。

条件やルシフェラーゼの増加を駆動するために使用されるプロモーターにもよりますが、プロモーター遺伝子の発現は1〜3時間後に検出できます。特定の実験では、例えば、政府の粒子に影響を与えることなく、脂質合成に対する特定の薬物の影響を研究するために、脂質合成からfalを切り離す必要があるかもしれません。このような場合は、細胞をビートで30〜16分間インキュベートし、細胞がビーズを細胞化できるようにします。

このインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、取り込まれていないビーズを取り除きます。次に、新鮮な培地を添加し、細胞を6〜16時間インキュベートして遺伝子発現を報告します。これで、フェラスアッセイを進める準備が整いました。

Luciferアッセイを開始するには、実験に必要な十分な量を使用する前に、2,000万本の臼歯木、HCL pH H 7.8 10%体積から体積グリセロール、および0.5%体積から体積トリトンX 100を含むxisバッファーを準備します。次に、1モルDTTのミリリットルあたり1マイクロリットルで。残ったDT T溶液は再利用しないでください。

次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを最終濃度0.5〜1倍にして、初めてデュアルグローキットを使用するときは、デュアルグロールシファーバッファーの1つのボトルの全内容物をデュアルグロールシフェラーゼ基質の1つのボトルに移すことにより、ホタルルシファー試薬を調製します。未使用のルシフェラーゼ試薬を10ミリメートルの準角に分割し、マイナス20°Cで保存します。ルシフェラーゼ試薬の準備ができたら、96ウェルプレートを組織培養インキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。次に、吸引によって内側を切除し、ウェルあたり40マイクロリットルの溶解バッファーを追加し、プレートを氷上に30分間放置します。

次に、ウェルあたり15マイクロリットルのLucifer試薬。白色の不透明な96ウェルプレートには、Perkin Sオプティブプレート96を使用しています。その後、15マイクロリットルの細胞でプレートを室温で10分間食べてインキュベートします。

10分後、マイクロプレートリーダーで発光を読み取ります。次に、バニラルシファーアセイを実行して、コントロールプラスミドのデータをtoumします。これを行うには、直前に調製し、100部に1部のデュアルグロー、ストップ、グロー試薬を追加して、適切な量のルシフェラーゼ基質溶液を使用します。

デュアルグロー、ストップ、グローバッファ。次に、それぞれに15マイクロリットルの基質溶液を追加します。プレートを室温で10分間十分にインキュベートし、その後、再度発光を測定します。

これらのデュアルグローフェラスアッセイについて、メーカーが推奨するプロトコールを変更したことに注意してください。プロサンプルに必要な試薬の量を減らすために、プレートリーダーを使用してプレートを再度分析できるようになりました。マイクロプレートリーダーでデータを収集したら、Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムに転送してさらに分析することができます。

まず、切除されていない3つのウェルから平均を計算し、各データポイントからその値を差し引きます。次に、ホタルルシフェラーゼの値をよくトランスフェクトした各々について分割します。それをルシフェラーゼ用に購入し、次にトリプリケートサンプルの各セットについて、平均を計算し、次に偏差と変動係数を計算します。

この例では、バニラルカーの活動に対するホタルの比率に対してx軸上にプロットされたビーズの異なる濃度を使用します。ご覧のとおり、この比率には用量依存的な増加があります。ルシファーベースのレポート、遺伝子アッセイを使用して、ラテックス速度の食作用に応答してLDL受容体プロモーターからの発現を測定する方法を示しました。

この手順を実行するときは、トランスフェクションの時間として細胞がコンフルエントの80〜90%しかないことを確認することを忘れないでください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。