Name: ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 学ぶルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで、貪食誘導された膜生合成関連遺伝子発現を解析する方法。Dual-Glo™システムを用いて、細胞機能の分子メカニズムを解明する。

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細胞の文化<ol><li>ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の保存培養は抗生物質のカクテル（ペニシリンのmlあたり100個および100μgを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で構成される&quot;中&quot;、で10cmの培養皿で増殖させるストレプトマイシン硫酸のml当たり）及び10％ウシ胎児血清（FBS）。 </li><li>実験用セルを設定するには、培地を吸引し、細胞をリン酸5mlで2回洗浄している生理食塩水（PBS）ソリューションをバッファ。 </li><li> PBSを除去し、0.25％トリプシンを含む溶液0.6 mLで置き換えられます。 </li><li>細胞がデタッチし始めているまで、皿を37˚Cで約2分間インキュベートする。 </li><li>培地5.5 mlのトリプシンを中和するために添加し、細胞を、血球計でカウントされます。 </li><li>細胞を、1ml当たり32万細胞に希釈し、ポリリジンコートした96穴培養プレートにウェルあたり0.1ミリリットルで分配される。 </li><li> 37˚C 8.8％CO2を含む大気中で組織培養インキュベーター中に皿を置き、24時間のために成長する。 </li></ol>トランスフェクション<ol><li>トランスフェクションのための準備では、実験条件とどのようなプラスミドの量はトランスフェクションされるごとに実行するかを多くの複製を考慮する必要があります。我々は日常的に三連のすべての条件を実行し、ウェルあたりのプラスミドDNAの50〜100 ngの合計をト​​ランスフェ。プラスミドミックスは、少なくとも記者はホタルルシフェラーゼと構成的プロモーターからの制御を発現するプラスミドウミシイタケルシフェラーゼを発現するコンストラクト含める必要があります。 </li><li>プラスミド溶液は1.5 mlのマイクロ遠心チューブにピペットと無血清および抗生物質を含まないDMEMのサンプルあたり10μLで補足されています。たとえば、20の井戸がそれぞれが50μgのDNAをトランスフェクトされる場合は、1μgのDNAに200μlのDMEMを加える。 </li><li> DMEM / DNA溶液に、μgのDNA当り3μlの&quot;トランジット293試薬&quot;（Mirus）を追加します。 ＆上下にピペッティングして混合し、少なくとも10分間室温で試料を放置する。 </li><li>この期間中、96ウェル培養プレートから培地を除去し、新鮮な培地Aの90μlのと交換してください</li><li>それぞれによくDMEM / DNA /トランジット293混合物の10μlを加える。 </li><li> 37˚C 8.8％CO2を含む大気中で組織培養インキュベーター中に皿を置き、24時間のために成長する。 </li></ol>貪食<ol><li>培地B（DMEMとHamのF12培地に加えて抗生物質の1:1混合物と10％FBS）を加えたml当たりゼロから1 mgで0.75μmのラテックスビーズを含む懸濁液を準備する。 </li><li> 96ウェル培養プレートからメディアを取り出して、培地Bのビーズ懸濁液0.1 mlを交換してください</li><li> 1000 × gで2分間プレートを回転させる</li><li>次に、細胞を6〜16時間、37˚Cで培養されています。条件とルシフェラーゼを駆動するために使用されるプロモーターに依存し、増加したレポーター遺伝子の発現は、1〜3時間後に検出することができます。 </li><li>同じケースではそれが30〜60分間ビーズで細胞をインキュベートするために必要となる場合があります、その後、PBSで2回洗浄には取り込まれなかったビーズを除去し、時間の追加の期間の細胞をインキュベートする前に新鮮な培地を追加することです。 </li></ol>デュアルGloTMルシフェラーゼアッセイ<ol><li>注：このキットを使用するための我々のプロトコルは、メーカーが推奨することからいくつかの点で異なります。これは、サンプルごとに必要な試薬の量を減らすために変更されています。 </li><li> -20˚Cで複数の小分けや店舗に1 M DTT、除算の溶液を調製します</li><li>の20mM Tris - HCl（pH7.8）中、10％（v / v）グリセロール、および0.5％（v / v）のトリトンX - 100を含む溶解バッファーを準備します。使用前に、一定量の実験に必要な量をと1xを0.5の最終濃度に1 M DTTを加えたプロテアーゼ阻害剤カクテルのmlあたり1μlを追加。残りのDTT溶液を再使用しないでください。 </li><li>初めてデュアルGloTMキットを使用する場合は、デュアルGloTMルシフェラーゼ基質（提供の一瓶に（キットに付属）デュアルGloTMルシフェラーゼバッファの一瓶の内容全体を転送することにより（ホタル）ルシフェラーゼ試薬を準備するキット付き）。 -20˚Cで10 mlのアリコートとストアに使用されていないルシフェラーゼ試薬を分ける</li><li>組織培養インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、氷の上に置きます。吸引によってメディアを削除する、40μlをウェルあたりの溶解バッファーを追加して、氷上で30分間プレートを残す。 </li><li>白、不透明な96ウェルプレート（OptiplateTM - 96、パーキンエルマーカタログ番号6005290）のアリコート15μlをウェルあたりのルシフェラーゼ試薬、およびその後細胞溶解液の15μLを追加で。 </li><li>室温で10分間プレートをインキュベートし、マイクロプレートリーダーで発光をお読みください。 </li><li>使用直前に、1部デュアルGloTMストップ＆グロを追加することにより、ウミシイタケルシフェラーゼの基質溶液の適当量を準備®、100部に試薬（キットに付属）デュアルGloTMストップ＆グロ®バッファー（キットに付属）。 </li><li>それぞれによく、10分間室温でインキュベートウミシイタケルシフェラーゼの基質溶液15μlのウェルあたりを、追加してから、再度発光を測定します。 </li></ol>

著者らに開示すべき事項はありません。

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

膜の生合成中に別の脂質合成経路の調整を検討するためには、膜の生合成は、迅速かつ誘導的に発生した実験システムで動作するように便利です。我々は、細胞が急速に粒子の貪食時の材料のラッピングとして失わ膜プールを補充するために膜脂質を合成としてラテックスビーズの貪食は、これらの目的のために実用的であることを見出した。ここでは、プロメガからデュアルグロルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アプローチと貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。

膜生合成における異なる脂質合成経路の協調性を研究するには、膜の...（以下、原文が続く）という実験系を用いることが有用である。

こんにちは、私は脂質合成の異なる経路が、記憶および生合成にどのように協調しているかを研究しているIL OVです。膜生合成が迅速に、かつ誘導的に起こる実験系があることは非常に有用です。ラテックスビーズの食作用は、そのような研究に特に有用であることが分かりました。なぜなら、細胞は取り込みプロセスの初期段階でラップ材として失われた膜を補充するために、非常に迅速に新しい膜を合成するからです。このビデオでは、同僚のOng Zangが、ルシフェラーゼベースのリポーターアッセイ法を用いて、食作用によって誘導される遺伝子発現の変化を研究するための手順を実演します。こんにちは、私はハーバード大学分子細胞生物学部のXです。今日は、リポーター遺伝子アッセイを用いて、食作用後の膜生合成に関与する遺伝子の調節を分析する方法について説明します。それでは、始めていきましょう。本手順では、ヒト胚性腎臓293細胞の培養物を使用します。これらの細胞は、10 cm培養皿を用い、10%胎児血清（FBS）および抗生物質カクテルを添加したBasal Modified Eagle's Medium（DMEM）である培地Aで培養します。標準化技術を用いて細胞を皿の底面から剥離して計数し、ポリリシンコートを施した96ウェルプレートに播種して、トランスフェクションを開始するまで24時間培養します。トランスフェクションにおいて、我々は通常、すべての条件を3連（triplicate）で実施し、1ウェルあたり合計50～100 ngのプラスミドDNAをトランスフェクションします。プラスミド混合物には、少なくともホタルルシフェラーゼを発現するレポーター構築物と、構成的プロモーターからレニラルシフェラーゼを発現するコントロールプラスミドを含める必要があります。まず、血清不含および抗生物質不含のDMEMにTransIT-2K3トランスフェクション試薬を混合した溶液を調製します。トランスフェクションを行うウェル1つにつき10 µLのDMEMを使用し、プラスミドDNA 1 µgあたり3 µLのTransIT-2K3試薬を添加してください。例えば、各20ウェルに50 nanogramのDNAをトランスフェクションする場合、200 µLのDMEMに3 µLのtrans 2 9 3試薬を加えます。この溶液をピペッティングで繰り返し混ぜ合わせ、室温で少なくとも5分間静置します。次に、DNAを個別のマイクロ遠心チューブに分注します。なお、使用するプラスミドストック溶液の濃度は、通常10〜100 nanogram/µLの間です。DM M 移行混合液を5分間インキュベートした後、DNAチューブに移し、ピペッティングによって溶液を再び混合します。次に、サンプルを室温で20分間静置させます。この20分間のインキュベーションの間に、96ウェル培養

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生物学

幹細胞治療への関心の高まりとともに、分子イメージング技術は、移植後の幹細胞の挙動のモニタリングに最適です。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、細胞の生存、場所、およびin...

in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

このビデオは、ルシフェラーゼタグ付きタンパク質の定量に使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。このアッセイでは、目的のタンパク質と結合した小さなフラグメントと結合する大きなフラグメントで構成される人工的なルシフェラーゼ酵素を使用します。結合したサブユニットは活性酵素を形成し、基質の存在下で発光シグナルを放出します。次に、この信号をルミノメーターを使用して定量化します。...

ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

このビデオでは、タンパク質間相互作用を検出するための分割ルシフェラーゼ相補アッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質がルシフェラーゼ酵素の小さなフラグメントと大きなフラグメントにタグ付けされます。タンパク質が相互作用すると、大小の断片が結合して活性酵素複合体を形成し、特定の基質の存在下で測定可能な明るい発光を放出します。...

特異的なタンパク質間相互作用を同定するためのスプリットルシフェラーゼ相補アッセイ

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

乳腺上皮細胞での細胞の概日リズムを決定するための in vitro生物発光アッセイが表示されます。このメソッドは、期間...

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

遺伝的コード化ルシフェラーゼは、遺伝子発現の人気のある非侵襲的なレポーターです。ガスと温度最適化レコーダー (ワニ)...

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。...

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

概日リズムは、ほとんどの生物に存在し、生物学的プロセスの時間的組織を調節しています。3Dオルガノイドは、最近、生理学的に重要な in vitro モデルとして浮上しています。このプロトコルでは、オルガノイドの概日リズムを観察するための生物発光レポーターの使用について説明し、多細胞系の概日リズムの in vitro...

オルガノイドにおける生物発光レポーターによる概日振動のモニタリング

学ぶルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで、貪食誘導された膜生合成関連遺伝子発現を解析する方法。Dual-Glo™システムを用いて、細胞機能の分子メカニズムを解明する。

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

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