Name: アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶアフリカツメガエル卵母細胞を用いたパッチクランプ記録法。卵黄膜除去、ギガオームシール形成、アウトサイドアウトパッチ構成への移行を含む電気生理学的手法を解説し、イオンチャネル研究の基礎技術を習得できます。

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シュリンキングソリューションのレシピは、RWアルドリッチの研究室からです。国立衛生研究所、国立科学財団、米国心臓協会、筋ジストロフィー協会、ドナルドB.とデリアE.バクスター財団、Klingenstein基金と神経科学のためのマックナイト基金：我々は、サポートについては、次の資金提供機関や財団に感謝します。

パート1：卵黄膜を除去する<ol><li>鉗子のセットを2つ準備します。我々は1つのセットが若干ファイルで削ったされている5号鉗子を、好む。また7&quot;パスツールピペットをトリミングし、火災、研磨によってガラスの転送ピペットを準備。 </li><li> 推奨：滑りから卵母細胞を防止するために、グリッドのサークル（1 mmの正方形）をカットと60mmペトリ皿の底に接着剤。使用の間に清潔に保つ場合は、この料理は、無期限に再利用することができます。 </li><li>解剖顕微鏡下で高浸透液（レシピを参照）と場所と途中でペトリ皿を埋める。 </li><li>皿に洗練されたパスツールピペットや場所とのインキュベーション溶液から1月3日アフリカツメガエルの卵母細胞を取り外します。 </li><li> 15秒待ってから - セルのための2分を縮小するために開始する。長い時間が剥離し、細胞が容易になります。短い時間では、パッチ適用のための健康な細胞につながる。 </li><li>細胞が収縮するように、卵黄膜は、セルの上に透明層としてかろうじて目に見えるようになるに開始されます。剥離のための健康な細胞を（渦巻きまたは欠陥のない）]を選択します。 </li><li>鉗子の一組で、静かに形質膜にダメージを与えることなく、卵黄膜を把握する。他に、同じ場所の近くで持ち、ゆっくりと離れて明確な膜を引き裂き、細胞の自由。 </li><li>パスツールピペットで、慎重に録音室にセルを移動する。細胞は、卵黄の除去後に壊れやすいとなることに注意してください。 </li></ol>パート2：Gigaseal世代<ol><li>生理食塩水で記録ピペットを埋める。ピペット容量を最小限に抑えるために、電極ワイヤとの良好な電気的接触を行うソリューションの最小量を使用してください。 </li><li>ピペット数回は、泡が浮くと電極ワイヤの上にスライドできるようにするフリック。 満たされたピペットに圧力を適用する。これは、口からかペットショップから水槽のポンプを使用して行えます。この圧力は、液体の界面とセルへの移動を横切るようにピペットをきれいに保つことが重要です。 </li><li>チャンバー内の卵母細胞を見つけると、セルの端に鋭く焦点を当てる。 </li><li>バス、中央のセルの上（ピントの）先端からピペットで。これを最小限に抑え、時間は、シールの世代の前にお風呂で過ごした。 </li><li>セルの隣の鋭い焦点にピペットをドロップダウン。近い（〜50ミクロン）にそれをもたらす。あなたは、ソリューションの小さな歪みが、背圧によってピペットから押し出されるはずです。 </li><li>パッチクランプのソフトウェアを使用して、ピペットの抵抗を確認してください（私たちの目標はMΩ約3-4である）と、オフセット電圧を使用して電流をゼロにする。 </li><li>視覚的に抵抗を監視したり、周波数の抵抗に比例するトーンを生成するオーディオモニタを使用しながら、ピペットで正圧で、細胞に向かって徐々にヒントを移動します。先端が細胞に触れ始めると、抵抗が増加します。 </li><li>突然、かつ慎重に肯定からほぼ同じ絶対値の負圧に切り替える。抵抗は、形成をシールする増やす必要があります。 </li><li>時間の大半は、シールの形成は、数秒以内に行われます。時には30〜60秒が必要です。 </li><li>抵抗値が1GΩになると、圧力がニュートラルに解放することができます。今すぐ上のセルパッチを持っている。インサイドアウトのパッチの場合は、速やかに細胞から引き離します。外アウトの場合は、以下を参照してください。 </li></ol>第5部：外アウトトポロジ（オプション） <ol><li>すぐにgigaseal、破裂膜を達成した後。これは、鋭い吸引で行う、しかし、我々は1ミリ秒の1 Vのパルスを好むことができる。抵抗は、初期のピペットの抵抗よりも少しにドロップする必要があります。 </li><li>離れてゆっくりとスムーズに細胞からピペットを移動します。あなたは、ピペットで細胞のプルのセクションを参照してください。突然、数秒で、セルが跳ね返るだろうと抵抗がすぐにと同時にGΩsに返す必要があります。 </li><li>これで、外部のアウト設定のパッチを持っている。どんな付属のイオンチャネルのectodomainsはお風呂に公開されます。 </li></ol>パート6：予測される結果一般的に、より高い抵抗シールが好ましく、より長い寿命です。 10GΩは、高品質のシールのよいガイドラインになります。我々の経験では、この品質のシールを得ることのチャンスが特に多くの要因、細胞やピペットの品質によって異なります。パッチの取得率は健康な細胞、きれいなピペット、および経験豊富な研究者で95％以上にすることができます。これらのパッチは、何分間も続くとシングルチャネルの録音を含む、アフリカツメガエルの卵母細胞で発現するイオンチャネル、任意の電気生理学的研究に適している可能性があります。

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

ここで説明していない電気生理学的記録の多くのパラメータがあります。リグのセットアップ、システムのノイズ管理、チャネルの発現、および記録のプロトコルはすべての良い実験結果にも重要です。 我々の経験では、これらは信頼性の高いシールを形成するための最も重要なパラメータです：風呂に入るときに、高品質の卵母細胞は、（別名、&quot;はがれ&quot;）を迅速卵黄膜を除去し、ホコリから保護するため、新たに引っ張らピペット、滑らかなピペット、印加された正圧を使用してくださいソリューション、シーリングの前にお風呂に短い時間。これは言われて、経験は様々ですし、他の人は、最も重要な要因の独自のセットを持っている。

<table><tbody><tr><td>パッチクランプアンプ &amp;およびソフトウェア</td><td>器具</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>またはその他の同様の装置（例：HEKA EPC-9またはAxopatch 200B）</td></tr><tr><td>5番ピンセット（2本）</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卵母細胞収縮液</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>成分 量
N-メチル-D-グルカミン 220 mM
HEPES 10 mM
MgCl2 1 mM
EGTA 10 mM
アスパラギン酸 220 mM
KCl 2 mM
N-メチル-D-グルカミンでpH 7.4に調整</td></tr><tr><td>織物メッシュ</td><td>800 μm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

ザクマンとネーアー1、2による開発以来、パッチクランプ、細胞内の単一または複数のイオンチャネルの電気生理学的測定のための極めて有用な手法として確立されています。この手法は、両方のそれらのネイティブ環境でのイオンチャネルに適用され、そのようなアフリカツメガエル、アフリカツメガエルから採取した卵母細胞として異種細胞で発現することができます。ここで、我々は、アフリカツメガエルの卵母細胞からパッチクランプ記録の十分に確立された技法を説明します。この手法は、個々に個体数（macropatch）または（シングルチャンネル記録）のいずれかで表されるイオンチャネルの特性を測定するために使用されます。私たちは、卵母細胞の準備とシールの世代の品質を最大化するテクニックに焦点を当てる。すべての要因が最適で、この手法は90％以上成功したシールの生成の確率を与える。プロセスは、彼または彼女は最も重要な見つけるの要因に基づいてすべての研究者によって異なって最適化、そして私たちの手で最高の成功につながる持ってアプローチを提示することができます。

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。

SakmannとNeherによる開発以来1, 2、パッチクランプ法は電気生理学的な...のための極めて有用な手法として確立されました。

この手順は、パッチクランプ記録に必要なギガオームの抵抗を持つシールを正常に形成するために、Opus Cytesからビリン膜を除去することから始まります。オンセル・パッチクランプ構成が得られた後、ピペットに吸引を加えることで、ホールセル・パッチ構成として知られる状態で細胞質への電気的アクセスを得ることができます。その後、ピペットチップを細胞膜から引き離し、それが跳ね返るまで操作することで、チャネルの外向きドメインがバス溶液にさらされた小さな膜パッチを得ることができます。これはアウトサイドアウト・パッチ構成として知られています。こんにちは、スタンフォード大学分子・細胞生理学部のMiriam Goodman博士の研究室のAustin Brownです。私はGoodman研究室のBrandon Johnsonです。前回のビデオでは、電気生理学のためのパッチクランプピペットとシャープ電極の作製方法を実演しました。本日は、zpaに発現したイオンチャネルのパッチクランプ記録に関する導入について説明します。1970年代後半にS. SacramentoとAirによって開発されて以来、パッチクランプ法は、細胞内の単一または複数のイオンチャネルを電気生理学的に測定するための不可欠な手法として確立されてきました。それでは、始めていきましょう。パッチクランプピペットを卵母細胞の細胞膜に接触させるためには、外側の卵黄膜を除去する必要があります。まず、5番鉗子を2セット用意します。そのうち1セットの鉗子先を、やすりを用いてわずかに鋭利にします。また、7インチのパストゥールピペットをトリミングして火炎研磨し、細胞の滑落を防ぐためのガラス転送ピペットを用意します。さらに、0.8 mmの正方形のメッシュグリッドから円形に切り出したものを、60 mmペトリ皿の底に接着します。このシャーレは、使用後に洗浄して清潔に保てば、何度でも再利用可能です。次に、シャーレの半分まで高浸透圧溶液を満たし、解剖顕微鏡の下に置きます。ここで、ポリッシュペステールピペットを用いて、培養液から1〜3個のopus Cytesを取り出し、シャーレに入れます。細胞が収縮し始めるまで、15秒から2分間待ちます。収縮に伴い、ビリン膜が細胞上の透明な層としてにかすかに見え始めます。待機時間を長くすると細胞を剥離しやすくなりますが、時間を短くするとより健全な細胞が得られます。パッチクランプのために、渦巻きや欠損のない健全な卵母細胞を選択します。1組のピンセットで剥離し、もう1組のピンセットで形質膜を傷つけないようにヴィリン膜を慎重に掴みます。同じ箇所の近くを掴み、2組のピンセットを用いて透明帯をゆっくりと引き裂き、卵母細胞から1枚の破片として取り除きます。次に、パスチャールピペットを用いて、卵母細胞を記録チャンバーへ慎重に移動させます

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。...

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

私たちは、Xenopus卵子における酵素の不均一発現と、原子吸光分光光度法による個々の細胞へのRb+またはLi+の取り込みを測定することにより、K+逆輸送P型ATPaseの活性を定量化する方法を説明しています。この方法は、放射性同位元素フラックス実験に代わる高感度で安全な方法であり、複雑な速度論的研究を容易にします。...

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。...

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

カットオープンワセリンギャップアプローチは、高速チャネル動態の高解像度で、アフリカツメガエル卵母細胞で発現電位依存性イオンチャネルからのイオンおよびゲート電流の低ノイズの録音を得るために使用される。マイナーな変更を加えて、電圧クランプ蛍光法は、カットオープン卵母プロトコルに結合することができる。...

ザ·<em&gt;アフリカツメガエル</em蛍光測定で&gt;卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

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学ぶアフリカツメガエル卵母細胞を用いたパッチクランプ記録法。卵黄膜除去、ギガオームシール形成、アウトサイドアウトパッチ構成への移行を含む電気生理学的手法を解説し、イオンチャネル研究の基礎技術を習得できます。

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

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