成体マウスでの嗅覚行動試験

Rodin嗅覚系または嗅覚は、研究分野としてますます普及しています。嗅覚感度をテストするために、マウスを敷材のないケージ内で馴化させ、その後、濃度を段階的に上げた嗅覚物質を含むフィルターペーパーに曝露させます。そして、マウスがフィルターペーパーの探索に費やした時間を記録します。

嗅覚嗜好性試験も、まったく同様の手順で行われます。ただし、臭気物質の濃度を上げるのではなく、マウスが異なる臭気物質を探索に費やす時間を記録します。こんにちは、ハーバード大学医学部神経生物学科のRosalyn Siegel博士の研究室のRochelle Wittです。

こんにちは。Siegel LabのJennifer Denoです。本日は、嗅覚テストのための2つの手順をご紹介します。私たちは研究室でこれらの手順を用いて、嗅覚感度と嗅覚嗜好性の研究を行っています。

それでは、始めていきましょう。嗅覚感度試験の手順を開始するために、床材を入れていない清潔なケージを4つ用意します。ケージのサイズは、高さ8インチ、幅10インチ、長さ18インチである必要があります。

バイオセーフティキャビネット内に4つのケージを並べます。次に、不透明なろ紙を使用して、各アリーナの間に仕切りを設置します。その後、最後の仕切りに黒いポスターボードを配置し、ケージの側面と底面を覆います。

ケージの上部を透明なプレキシガラスで覆い、アリーナに光が入るようにします。次に、被験個体の馴化を開始します。最初の個体を1番目のケージに入れます。

15分後、1匹目の被験体を2番目のケージに移動させます。1番目のケージをQuatra side tbで清掃します。次に、2匹目の被験体を清掃済みの1番目のケージに入れます。

テストを行う前に、同様の手順を後続の被験体に対しても繰り返します。被験体のうち1匹を4番目のケージに入れ、さらに15分間順化させます。最終的に、最初の3つのケージそれぞれに1匹ずつの被験体が順化されている状態にします。

それでは、匂いサンプルの調製を行います。匂いサンプルは、被験体、遺伝子型、または条件について盲検化された、別の研究者が調製する必要があります。まず、2インチ×2インチの正方形のフィルターペーパーを必要数作成し、サンプルの調製を開始してください。

次に、あらかじめ選択した臭気をコニカルチューブで適切に希釈します。コントロール群と実験群を効果的に識別するためには、マウスの系統によって異なる臭気の希釈率が必要になる場合があることに留意してください。この観察結果に基づき、ナイーブマウスを用いた実験的試験に進む前に、コントロール群と同様の個体を用いて適切な臭気希釈率を経験的に導き出すことが有用であると考えています。ピーナッツバターのような疎水性試料にはオイルを溶媒として使用し、それ以外の試料には別の適切な溶媒を使用してください。

蒸留水を用いてボルテックスし、希釈液が適切に混合されていることを確認します。次に、ケージの端全体にピントが合うように、ドラフトチャンバーの奥にデジタルビデオ録画装置を設置します。カメラの設定が適切であることを確認するため、予備的なビデオ撮影を行ってください。

実験ノートに、希釈系列をテストする順序を記録します。この際、各試行において順序をランダム化するように注意してください。また、被験体のリター番号と個体識別番号も記録します。被験体がアリーナ内で15分間順化したら、最初の試行の準備を開始します。

コニカルチューブ内で最初の希釈液をピぺッティングして混ぜ合わせた後、フィルターペーパーの正方形部分に分注します。フィルターペーパーの表面の約85%が覆われている状態が最適です。フィルターペーパーが過剰に飽和していないことを確認するため、キムワイプを使用してください。

香料を染み込ませたフィルターペーパーの準備が整いましたので、最初の嗅覚感度試験を行います。試験を開始するために、ビデオ録画を開始してください。次に、動物の現在位置とは反対側のケージ端に、香料付きフィルターペーパーを設置します。

計測を開始します。3分後、記録を停止し、匂い刺激を除去します。次に、再びタイマーを開始し、2つ目の匂いサンプルを準備します。

1分後、ビデオ録画を開始します。前と同様に、動物の現在位置とは反対側のケージ端に匂いサンプルを配置します。この手順を各濃度の希釈サンプルおよび各個体に対して繰り返し、各試行のビデオファイル番号を記録してください。

嗅覚感度試験について説明しましたので、次に嗅覚嗜好性試験に進みます。嗅覚嗜好性試験では、嗅覚感度試験で説明した手順と同様に行いますが、2つのわずかな変更点があります。1つ目は、

あらかじめ選択した1種類の香料を多段階希釈して調製するのではなく、誘引性の香料と忌避性の香料の両方を調製します。次に、テストする希釈倍率を記録するのではなく、各試行で順序をランダム化し、提示する刺激の順序を記録します。被験者の馴化、ブラインド法を用いた研究者の配置、ろ紙への香料の塗布、および各試行のビデオ録画による時間計測を含む、その他の手順はすべて嗅覚テストと同様です。

嗅覚嗜好性試験が完了したら、嗅覚試験のスコアリングに進みます。すべての嗅覚感度および嗜好性のビデオを揃えた後、被験者が各希釈液または scents を探索して過ごした総時間を算出し、一貫性を確認します。この解析は、ブラインド（盲検）状態で研究者がビデオを分析して行ってください。

まず、ビデオをプレビューし、以下の点に留意しておくと役立ちます。フィルターペーパーがアリーナに配置されたタイミング、マウスがフィルターペーパーに近づいたタイミング、マウスがフィルターペーパーを探索したタイミング、およびフィルターペーパーを最初にアリーナに配置してから3分が経過したタイミングを確認してください。マウスの行動に注目すべきタイミングを把握しておくことで、後の見直し時に探索に費やした合計時間を正確にスコアしやすくなります。ビデオ全体を確認しながら、フィルターペーパーをアリーナに配置してからの3分間におけるすべての探索時間をストップウォッチで計測してください。

調査時間は、マウスの鼻がフィルターペーパーから1 mm未満の距離にある時間として定義されます。マウスがフィルターペーパーの至近距離にいても、積極的に調査していない時間は含めないようにすることが重要です。総探索時間には、ペーパーを噛んだり舐めたりしている時間や、ペーパーの上に座っている時間は含めないでください。嗅覚行動を正確に分析するため、これらのルールを厳格かつ一貫して適用してください。

ビデオ記録を確認し、フィルターペーパーの調査に費やした合計時間を記録した後、すべてのビデオについて分析を繰り返します。以下は、嗅覚テストの代表的な結果です。最初のチャートは、嗅覚感度トレーニングのセッションの結果を示しています。

実験群Bまたは対照群Aの各マウスを、フィルターペーパーに染み込ませた5種類の異なる希釈率のシナモン抽出液のいずれかに、1回3分間曝露させました。フィルターペーパーの探索に費やした合計時間を評価し、このチャートに嗅覚嗜好性試験の1セッションの結果を示しています。各マウスは、フィルターペーパー上の異なる各香りに1回3分間ずつ曝露されました。

フィルターペーパーの探索に費やされた合計時間を評価しました。以上の手順を用いて成マウスの嗅覚能力をテストする方法をご紹介しましたが、学習や記憶などの他の能力ではなく、嗅覚能力を正確にテストするためには、未経験のマウスを使用することが重要です。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。