改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

この手順は、ピペットチップを研磨フィラメントの近くに100倍の倍率で配置することから始まります。次に、空気圧と加熱をオンにします。フィラメント。

ピペットの先端が膨張して鈍い形状の先端を形成します。火を止めて、先端の開口部を小さくします。圧力をオフにして、再度加熱します。

こんにちは、スタンフォード大学分子細胞生理学部のミリアム・グッドマン博士研究室のブランドン・ジョンソンです。今日は、パッチピペットの加圧研磨の手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いてイオンチャネルや膜パッチ、NCエルガン神経細胞の研究を行っています。

それでは始めましょう。6〜10個のパッチピペットのセットを引っ張ります。地元の専門家に相談するか、プログラム可能な極性を備えたパッチピペットと鋭利な電極を作成する視覚化された実験に相談してください。

手順を開始するには、圧縮されたエアライン圧力を約40PSに設定します。次に、圧縮されたエアラインを4方向制御バルブに接続します。プラスチックチューブを4方向バルブに接続し、プラスチックチューブの緩い端に高圧ピペットホルダーを取り付けます。マイクロ鍛造リグを使用して研磨を行います。

LA ScientificのCcpm twoキットを使用しています。このリグには、高圧ピペットホルダー、フットペダルで制御されるプラチナヒーティングフィラメント、100倍の長さで10倍と高倍率の低倍率と高倍率を備えた顕微鏡があります。ワーキングディスタンスエアオブジェクティブは、プロトコール中にピペットの開口部を観察できることが重要であるため、理想的です。

次に、圧力バルブがオフの位置にあることを確認します。次に、ピペットをピペットホルダーに入れ、ラボの安全のためにフィッティングを指で締めます。ピペットがピペットホルダーにしっかりと保持されていることを確認してください。

そうしないと、空気圧によってピペットがホルダーから排出されます。オプションのステップとして、ピペットをワックスなどの疎水性絶縁体でコーティングして、静電容量を減らし、ノイズ特性を改善することができます。次に、ピペットをホルダーにマイクロフォージにセットし、ピペットホルダーを顕微鏡ステージに配置して、チップとポリッシングフィラメントの両方がマイクロフォージの10倍の低電力で見えるようにします。

チップをフィラメントから約50ミクロン離し、高倍率100対物レンズに切り替えると、ピペットチップとポリッシングフィラメントの両方が焦点を合わせ、視野に入る必要があります。そうでない場合は、フィラメントの高さを調整します。ピペットの位置は調整できないため、ピペットチップとフィラメントは視野の反対側にある必要があります。

ピペットチップをフィラメントに近づけすぎると、フィラメントが加熱されると膨張し、ピペットにぶつかる可能性があるため、フィラメントに近づけすぎないでください。チップとフィラメントが適切に配置されたら、バルブを回して加圧空気をピペットに送り、チップの後ろのテーパーが外側に膨らみ始めるまでピペットチップを加熱します。先端が膨らみすぎる前に加熱を止めてください。

目的の形状に適した距離、熱、時間を決定するには、実験が必要です。オプションのステップとして、先端の開口部の直径を小さくするために、圧力がない状態で先端を研磨することもできます。また、これらの研磨手順は細かく繰り返すことができることに注意してください。

ピペットチップの形状と寸法の両方を調整します。研磨が終わったら。ピペットの先端を安全な方向にツボのスイッチを切ります。

ピペットを取り外し、ほこりから保護される清潔な収納ボックスに入れます。ラボの安全のため、ピペットを取り外す前に必ず圧力をオフにしてください。そうしないと、ピペットホルダーから排出される可能性があります。

取り外し後、パッチクランプの録音を改善するためにピペットを加圧研磨する方法を示しました。この手順を実行するときは、ピペットに気化した金属の堆積を最小限に抑えるために、研磨コイルを高融点ガラスでコーティングすることを忘れないようにすることが重要です。また、ピペットが加圧された空気にさらされている間は注意してください。

ピペットがホルダーにしっかりと固定されていることを確認し、ピペットをホルダーから取り外す前に空気を止めてください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます。

あなたの実験に幸せな圧力研磨と幸運を。