改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

この手順は、100倍の倍率でピペットチップを研磨フィラメントの近くに配置することから始めます。次に、空気圧と加熱をオンにします。フィラメントです。

ピペットチップが膨張し、鈍い形状のチップが形成されます。加熱を停止して、チップの開口部を小さくします。その後、再度圧力と加熱を停止します。

こんにちは。スタンフォード大学分子・細胞生理学部のMiriam Goodman博士の研究室のBrandon Johnsonです。本日は、パッチピペットのプレッシャーポリッシングの手順について解説します。当研究室では、C. elegansのニューロンにおけるイオンチャネルや膜パッチの研究にこの手順を用いています。

それでは始めましょう。パッチピペットを6本から10本用意します。詳細については、専門家に相談するか、プログラマブルポリシャーを用いたパッチピペットおよび鋭利電極の作製に関する視覚化実験を参照してください。

手順を開始するには、圧縮空気ラインの圧力を約 40 PS.I に設定します。次に、圧縮空気ラインを4方制御バルブに接続します。プラスチックチューブを4方バルブに接続し、チューブの端に高圧ピペットホルダーを取り付けます。研磨にはマイクロフォージリグを使用します。

LA Scientific社のCcpm twoキットを使用します。この装置には、高圧ピペットホルダー、フットペダルで制御される白金加熱フィラメント、および10倍と100倍の低・高倍率対物レンズを備えた顕微鏡が搭載されています。プロトコル中にピペットの開口部を観察できることが極めて重要であるため、作動距離の長い空中対物レンズが理想的です。

次に、圧力バルブがオフの位置にあることを確認します。その後、ピペットホルダーにピペットをセットし、研究室の安全のため、継手を指で締め付けます。ピペットがピペットホルダーにしっかりと固定されていることを確認してください。

そうしないと、気圧によってピペットがホルダーから飛び出してしまう可能性があります。オプションの工程として、静電容量を減少させノイズ特性を改善するために、ワックスなどの疎水性絶縁物でピペットをコーティングすることができます。次に、マイクロフォージのホルダーにピペットをセットし、マイクロフォージの低倍率（10倍）でチップと研磨用フィラメントの両方が見えるように、ピペットホルダーを顕微鏡ステージ上に配置します。

チップをフィラメントから約50 µmまで近づけ、その後、高倍率の100倍対物レンズに切り替えます。このとき、ピペットチップと研磨用フィラメントの両方がピントが合った状態で視野に入っている必要があります。入っていない場合は、フィラメントの高さを調整してください。ピペットの位置は調整できないため、ピペットチップとフィラメントは視野の反対側に位置するようにしてください。

フィラメントは加熱されると膨張し、ピペットに接触する可能性があるため、ピペットチップをフィラメントに近づけすぎないようにしてください。チップとフィラメントが適切に配置されたら、バルブを回して加圧空気をピペットに送り込み、チップ後方のテーパー部分が外側に膨らみ始めるまでピペットチップを加熱します。チップが過度に膨張する前に加熱を停止してください。

目的の形状を得るためには、適切な距離、熱量、および時間を決定するための試行錯誤が必要です。オプションの手順として、チップの開口径を小さくするために、圧力をかけない状態でチップ先端を研磨することも可能です。また、これらの研磨ステップは、微調整のために繰り返し行うことができる点に留意してください。

ピペットチップの形状と寸法を調整します。研磨が完了したら、圧力を停止し、ピペットチップを安全な方向に向けてください。

ピペットを取り外し、ホコリから保護される清潔な保管ボックスに入れます。研究室の安全のため、ピペットを取り外す前に必ず圧力をオフにしてください。そうしないと、ピペットホルダーからピペットが飛び出す可能性があります。

以上で、パッチクランプ記録の精度向上のためのピペットのプレッシャーポリッシング方法について説明しました。この手順を行う際は、気化した金属がピペットに付着するのを最小限に抑えるため、研磨コイルを高融点ガラスでコーティングすることが重要です。また、ピペットに加圧空気が供給されている間は、十分に注意して取り扱ってください。

ピペットがホルダーにしっかりと固定されていることを確認し、ホルダーからピペットを取り外す前に空気を止めてください。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。

プレッシャーポリッシングがうまくいくこと、そして皆様の実験が成功することを願っております。