Name: 改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学ぶ パッチクランプ記録のための圧力研磨ピペット法。ガラスマイクロピペットを熱と空気圧で形状加工し、先端を広げずに抵抗を低減して小細胞からの低ノイズ記録を実現する神経科学技術です。

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圧力研磨技術は、SRのLockeryと共同で開発されました。

引っ張っピペットプーラーのようなフィラメントを使用すると、サッタはP - 97 /ブラウン微小電極プラーをフレーミング、約10〜20ピペットのセットを引き出します。 <ol><li>あなたのガラスを選択してください。我々は、ホウケイ酸（BF150 - 86 - 10、OD = 1.5 mm、内径0.86 mm）を使用してください。それは自由な汚れやほこりを保つように慎重にガラスを保管​​してください。 </li><li>引っ張ってプログラムを設計します。主な目標は、アプリケーションに依存する約希望のサイズを、開けるヒントです。サターのP - 97ピペットクックブック 2は優れたリファレンスです。 </li><li>開口径と滑らかさを決定するために顕微鏡下でピペットを守ってください。荒い、でこぼこ、または不規則なヒントを捨てる。標準のパッチクランプ記録の場合は、全体で2から4μmであるティップオープニングは最高です。鈍先端が好まれているのと同じ開口径、より低い抵抗値につながる。形状とサイズは以下に、研磨中に修正することができます。 </li></ol>圧力の研磨ピペット<ol><li>きれいな、圧縮空気ラインにピペットホルダーを取り付けます。レギュレータを使用して、〜40 PSIへの圧縮空気ラインの圧力を設定します。オンとオフにするピペットホルダーの圧力を可能にする4方向制御弁、圧縮空気ラインを接続します。タイゴンの⅛の長®チューブと制御弁にピペットホルダーを接続してください。 </li><li>高圧ピペットホルダー、フットペダル、低と高倍率、長作動距離（理想的には、10倍および100倍）空気の目標を装備した顕微鏡によって制御される研磨コイルで研磨リグ（マイクロフォージ）を使用してください。これは、プロトコル中にピペットの開口部を観察できることが重要です。 </li><li> オプション ：コート静電容量を減少させると（このテクニックのための&quot;引っ張るピペット&quot;を参照）ノイズ特性を向上させるために疎水性の絶縁体とのピペット。 </li><li>圧力弁がオフの位置にあることを確認します。ピペットホルダーにピペットを置き、指締めに金具を締めます。 安全上の注意 ：ピペットをピペットホルダーにしっかりと保持されている場合、空気の圧力がピペットをピペットホルダーから排出するようになります。 </li><li>マイクロフォージのピペットとホルダーを置きます。顕微鏡ステージ上に位置ピペットホルダーは、その先端と研磨コイルの両方は、マイクロフォージで低い（10倍）電源投入時に表示されていること。 〜75ミクロンのフィラメントからヒントをもたらす。加熱するとフィラメントが拡大することに留意してください。 </li><li>ハイパワー（100倍）目標に切り替えます。ピペットチップや研磨コイルの両方が焦点に、ビューのフィールドにしてください。されていない場合は、研磨コイルの高さを調整する。 （ピペットの位置を調整することができます）。ピペットチップや研磨コイルは、ビューのフィールドの反対側に近づける必要があります。それが加熱されると拡大して、ピペットにぶつかるだろうので、あまりピペットの先端に近いコイルを配置することは避けてください。 </li><li>ピペットに加圧空気を指示するためにバルブを回し、そして先端の後ろのテーパーが外側に膨らむし始めるまでピペットの先端を加熱する。 </li><li>先端があまりにも広範囲にバルーンの前に加熱を停止します。実験は、所望の形状のために適切な距離、熱、および時間を決定するために必要です。 </li><li> オプション ：圧力のない状態で先端を研磨することにより先端の開口径を小さくしてください。手順7と8は、微調整するために、ピペットチップの形状と大きさの両方を繰り返すことができる。 </li><li>圧力スイッチをオフにし、安全な方向にピペットチップを指さしながら、ピペットを削除し、それが埃から保護されるクリーンな収納ボックスに入れてください。 安全上の注意 ：空気の圧力がオフになっていない場合、ピペットを除去中にピペットホルダーから取り出すことができる。 </li></ol>マイクロフォージについてのメモ我々は、既製の市販の部品から組み立てマイクロフォージを使用してください。 （また、いくつかの企業、たとえば、ALA科学、GlassWorxから圧力研磨キットを購入することができます）。に関係なく、マイクロフォージの、それはしばしば直径数μmの先端の開口部を、見て十分な光学系を持つことが不可欠です。我々はこの目的のために長い作動距離100倍レンズを使用してください。また、コートオーダーの高融点ガラスによる研磨コイルは、ピペットで蒸発した金属を堆積最小限に抑えます。 パート3：予測される結果 適度な圧力の研磨は、直径を開くに明らかな変化なしにピペットの抵抗を減らすことができます。必要に応じて、このプロトコルは、510MΩの間にサブミクロンの開口部と抵抗とのピペットを作るために使用することができます。

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

私たちは、もともとCの 2〜3μmの神経細胞からパッチクランプ記録用ピペットを有用にするためにこの方法を開発エレガンス 1。それは、グッドマンの研究室で日常的に使用しています。我々は小さなCから録音用だけでなく、圧力、研磨ピペット線虫の神経細胞だけでなく、アフリカツメガエルの卵母細胞で発現するイオンチャネルのmacropatchとシングルチャネル記録を得るため。与えられた先端開口径の場合は、鈍い形状は、低抵抗のピペットを生成します。低ピペット抵抗が低い直列抵抗と低ノイズの録音につながる。

<table><tbody><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>消耗品</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10（または同等品）</td><td>本手法は、石英製を除くあらゆる種類のキャピラリーで使用可能です。ただし、フィラメント付きのキャピラリーの使用を推奨します。</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL（または同等品）</td><td>シンプルな倒立顕微鏡であれば何でも構いません。ただし、研磨中にピペットを確認できる十分な倍率が必要です。この目的のために、当社では作動距離の長い100倍の金属顕微鏡用レンズを使用しています。</td></tr><tr><td>マイクロフォージキット</td><td>ツール</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>研磨用コイル、コントローラー、フットペダルが付属します。</td></tr><tr><td>空気圧源</td><td>ツール</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>高圧を供給するためのアクセサリーで、適切なバルブが含まれています。あるいは、建物の圧縮空気と、フィルター/レギュレーター（40 PSIに設定）および4方バルブ（以下に記載）を組み合わせて使用することも可能です。</td></tr><tr><td>4方バルブ</td><td>ツール</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>バルブとチューブを接続するためにフィッティングが必要になります。</td></tr><tr><td>ルアーコネクタ付きピペットホルダー</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>オス・ルアー・トゥ・バーブ・フィッティングを使用して、ピペットホルダーを高圧チューブに接続してください。</td></tr><tr><td>Tygon&amp;#174;チューブ</td><td>ツール</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>このチューブを使用して、ピペットホルダーを4方バルブに接続してください。</td></tr></tbody></table>

改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

圧力研磨は、パッチクランプ記録用ガラスピペットを整形するための方法です。我々は、最初に小さな（&lt;3 m）のニューロン細胞体から記録に適したピペットを作製するためにこの方法を開発した。基本的なプリンシパルは、ガラス吹きと類似しており、従来のマイクロピペットプラーが作成したパッチピペットの形状を変更するには、空気の圧力と熱を兼ね備えています。それは、いわゆるソフト（ソーダ石灰）とハード（ホウケイ酸）ガラスに適用することができます。一般的に言えば、圧力の研磨は、先端開口部（グッドマンとLockery、2000）の直径を減少させることなく25％ピペット抵抗を減らすことができます。それはガラスのほぼすべてのタイプに適用され、高圧バルブとマイクロフォージへのフィッティングの添加のみを必要とすることができます。この手法は、超小型の細胞（&lt;5 m）からの録音に必須であり、またピペットの抵抗を最小限に抑えることで、シングルチャンネルの記録を向上させることができます。鈍形の穿孔のための利用可能な大規模な膜のブレブのこの先端形状の結果以降も穿孔、パッチクランプ記録するのに便利です。

これは、ガラスマイクロピペットの形状を変更するためのガイドです。特に、熱や空気圧を使用してテーパーが低いピペットの抵抗につながる、先端の開口部を増やすことなく広げている。これは、小さな細胞の低ノイズ記録を取得することが重要ですが、多くのアプリケーションで有用です。

プレッシャーポリッシングは、パッチクランプ記録用のガラスピペットを成形するための手法である。我々はまず、…に適したピペットを作製するために本手法を開発した。

この手順では、まず100倍の倍率でピペットチップを研磨フィラメントの近くに配置します。次に、空気圧と加熱を開始します。フィラメントを操作します。ピペットチップが膨張し、鈍角な形状のチップになります。加熱を停止して、チップの開口部を小さくします。再度、圧力と加熱を停止します。こんにちは。スタンフォード大学分子・細胞生理学部のMiriam Goodman博士の研究室に所属しているBrandon Johnsonです。本日は、パッチピペットのプレッシャーポリッシングの手法について解説します。当研究室では、C. elegansニューロンのイオンチャネルや膜パッチの研究にこの手法を用いています。それでは始めましょう。6〜10本のパッチピペットを用意します。詳細は、専門家に相談するか、プログラマブル・プラーを用いたパッチピペットおよび鋭利電極の作製に関する視覚化実験を参照してください。手順を開始するために、圧縮空気ラインの圧力を約 40 PS.I に設定します。次に、圧縮空気ラインを4方制御バルブに接続します。プラスチックチューブを4方バルブに接続し、チューブの自由端に高圧ピペットホルダーを取り付けます。研磨にはマイクロフォージ装置を使用します。LA Scientific社のCcpm twoキットを使用します。この装置には、高圧ピペットホルダー、フットペダルで制御される白金加熱フィラメント、および低倍率（10倍）と高倍率（100倍）の作動距離の長い空気対物レンズを備えた顕微鏡が搭載されています。プロトコル中にピペットの開口部を観察できることが極めて重要であるため、作動距離の長い対物レンズが理想的です。次に、圧力バルブがオフの状態であることを確認します。その後、ピペットをピペットホルダーにセットし、ラボの安全のため、フィッティングを指で締め付けます。ピペットがピペットホルダーにしっかりと固定されていることを確認してください。そうしないと、気圧によってピペットがホルダーから飛び出してしまう可能性があります。オプションのステップとして、静電容量を減少させノイズ特性を向上させるために、ワックスなどの疎水性絶縁剤でピペットをコーティングすることができます。次に、ピペットをホルダーにセットし、マイクロフォージを顕微鏡ステージ上に配置して、ピペットの先端と研磨用フィラメントの両方が、マイクロフォージの10倍の低倍率で確認できるようにしてください。チップをフィラメントから約50 µmまで近づけ、次に高倍率の100倍対物レンズに切り替えます。このとき、ピペットチップと研磨用フィラメントの両方がピントが合い、視野に入っている必要があります。入っていない場合は、フィラメントの高さを調整してください。ピペットの位置は調整できないため、ピペットチップとフィラメントが視野の両端に位置するように配置してください。フィラメントは加熱されると膨張し、ピペットに接触する可能性があるため、ピペットチップをフィラメントに近づけすぎないようにしてください。チップとフィラメントが適切に配置されたら、バルブを回して加圧空気をピペットに送り込み、チップ後方のテーパー部分が外側に膨らみ始めるまでピペットチップを加熱します。チップが過度に膨張する前に加熱を停止してください。目的の形状を得るためには、適切な距離、熱量、および時間を決定するための試行錯誤が必要です。オプションの工程として、チップの開口径を小さくするために、圧力をかけずにチップ先端を研磨することも可能です。また、これらの研磨工程は、微調整のために繰り返し行うことができる点に留意してください。ピペットチップの形状と寸法を調整します。研磨が完了したら、圧力を遮断し、ピペットチップを安全な方向に向けてください。ピペットを取り出し、ほこりが付かないように清潔な保管ボックスに収納してください。研究室の安全のため、ピペットを取り外す前に必ず圧力をオフにしてください。そうしないと、ピペットホルダーからピペットが飛び出す可能性があります。以上で、パッチクランプ記録の精度を向上させるためのピペットのプレッシャーポリッシングの手順について説明しました。この処置を行う際は、気化した金属がピペットに付着するのを最小限に抑えるため、ポリッシングコイルを高融点ガラスでコーティングすることが重要です。また、ピペットが加圧空気にさらされている間は十分な注意を払ってください。ピペットがホルダーにしっかりと固定されていることを確認し、ホルダーから取り出す前にエアをオフにしてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。プレッシャーポリッシングがうまくいくこと、そして実験の成功を願っております。

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