Name: protein purification with sec and imac
Uploaded: 2023-04-30T06:30:54.000Z
Duration: 7 min 51 s
Channel: JoVE

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

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Chromatography-based Biomolecule Purification Methods

생화학에서, 크롬토그래피 계 정제 방법은 복합 혼합물로부터 화합물을 분리하기 위해 사용된다. 생화학자에 의해 일반적으로 이용되는 2개의 그 같은 방법은 크기 배제 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피입니다. 크기 배제 크로마토그래피에서 다공성 구슬로 포장된 컬럼은 크기에 따라 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 한편, 친화성 크로마토그래피는 표적 특이적 리간드를 포함하는 고정 상으로 구성된 컬럼을 사용하여 생체 분자의 보다 구체적인 분리를 허용한다.
이 비디오는 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 이를 제어하는 개념에 대한 소개 역할을 합니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의한 히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차가 설명된다. 생화학 및 생의학 연구에서 이러한 크로마토그래피 방법을 모두 위한 응용 프로그램도 프로파일화되어 있습니다.

크로마토그래피 기반 생체 분자 정화 방법

생화학에서, 크롬토그래피 계 정제 방법은 복합 혼합물로부터 화합물을 분리하기 위해 사용된다. 생화학자에 의해 일반적으로 이용되는 2개의 그 같은 방법은 크기 배제 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피입니다. 크기 배제 크로마토그래피에서 다공성 구슬로 포장된 컬럼은 크기에 따라 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 한편, 친화성 크로마토그래피는 표적 특이적 리간드를 포함하는 고정 상으로 구성된 컬럼을 사용하여 생체 분자의 보다 구체적인 분리를 허용한다.
이 비디오는 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 이를 제어하는 개념에 대한 소개 역할을 합니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의한 히스티딘 태그 단백질의 정제를 위한 단계별 절차가 설명된다. 생화학 및 생의학 연구에서 이러한 크로마토그래피 방법을 모두 위한 응용 프로그램도 프로파일화되어 있습니다.
<div class="chapter_text" id="script_0">
"크로마토그래피"는 복잡한 혼합물로부터 성분을 분리하는 데 사용되는 광범위한 방법을 말하며, 생체 분자의 특성 및 활동이 결정되기 전에 필수적인 단계입니다. 각 크로마토그래피 기술은 샘플 매트릭스 및 표적 화합물에 따라 분리를 위한 다른 메커니즘을 가지고 있습니다. 이 비디오는 생화학에 공통된 두 가지 방법의 원리와 작동에 초점을 맞출 것입니다: 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC는 샘플내 화합물의 크기를 기반으로 합니다. 시료를 포함하는 이동상이 다공성 물질이 있는 컬럼에 고정된 위상을 추가합니다. 샘플의 분자는 3가지 범주 중 1개로 떨어집니다.
모공을 입력하기에는 너무 큰 분자가 컬럼을 통해 가장 짧은 거리를 이동합니다. 이 "배제 한계"를 초과하는 분자량을 가진 모든 종은 동시에 열을 종료합니다. 모공을 자유롭게 입력할 수 있을 만큼 작은 분자는 가장 오래 유지되고 컬럼을 함께 종료합니다. 완전한 기공 입구를 허용하는 분자량은 "투과 한계"입니다.
이러한 한계 사이의 분자만 모공 안팎으로 확산되는 데 다양한 시간을 소비하기 때문에 서로 분리됩니다. 더 작은 분자는 고정 된 단계에서 더 많은 시간을 보내고 있기 때문에 컬럼에서 더 오래 유지되는 반면, 이러한 한계 내에서 더 큰 분자는 이전에 종료됩니다.
1~ 2개의 진도에 걸친 분자량은 이러한 한계 내에 속한다. 이 점을 염두에 두고 컬럼을 선택하거나 원하는 화합물의 넓은 범위가 있는 경우 여러 열을 연속으로 사용할 수 있습니다.
이제 SEC의 이론을 보았으니 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
SEC 절차를 시작하려면 열에 분산된 물과 크로마토그래피 버퍼로 평형화되어야 합니다. 준비되면 샘플을 포함하는 버퍼가 열에 주입됩니다. 그런 다음 버퍼는 낮은 유량으로 밀어버리게 됩니다. 검출기는 열을 종료하는 것을 모니터링하여 원하는 단언의 존재를 확인합니다. 배제 한계 이상의 분자량을 가진 큰 분자는 동시에 컬럼을 종료합니다. 컬럼의 작은 분수는 튜브로 수집됩니다. 각 분획은 겔 전기전도 또는 기타 분석 기술에 의해 표적 분자의 품질을 테스트합니다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
이제 단백질을 정화하는 가장 효율적인 방법 중 하나인 친화성 크로마토그래피 또는 AC를 살펴보겠습니다. 많은 생체 분자는 AC가 고정 된 단계에 표적 별 리간드를 준수하여 활용하는 특정 리간드 -a 속성에 선택적으로 결합합니다.
혼합물이 컬럼을 통해 흐르면, 표적 분자는 리간드에 부착하고 나머지는 흐른다. 혼합물이 컬럼을 통과한 후, 표적 분자는 특이성에 기초하여 2개의 용출 방법 중 하나를 통해 수집될 수 있다.
생물특이적 용출은 "정상" 또는 "역역할"을 가지고 있다고 할 수 있다. 정상적인 역할 바이오특이적 용출에서, 표적 생체 분자와 결합하기 위해 부착된 리간드와 경쟁하는 에이전트가 추가됩니다.
역역할 바이오특이적 용출에서, 에이전트는 부착된 리간드에 결합하기 위해 대상과 경쟁한다. 제2 용출 형, 비특이적 용출은용액의 pH, 이온 강도 또는 극성을 변경하여 표적-리그-리간드 결합을 낮춥춥니까. 단백질이 고정될 수 있는 리간드에 결합하지 않으면, 단백질은 "태그"를 함유하여 표현될 수 있다: 리간드에 결합하도록 설계된 짧은 펩티드 서열.
한 가지 다양성은 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피, "IMAC"짧은, 여기서 부착 된 금속 리간드, 니켈이나 코발트와 같은, 수정 된 단백질에 히스티딘 잔류물에 결합. 분자 생물학 기술을 통해, 표적 단백질은 히스티딘의 이미다졸 사이드 체인을 통해 금속에 결합하는 폴리히스티딘 태그라고 불리는 히스티딘 잔류물을 반복하여 생성됩니다. 일단 결합되면, 단백질은 역역할 특정 용출을 통해 무료 imidazole로 수집될 수 있고 나중에 다양한 다운스트림 응용 분야에서 사용될 수 있습니다. 이제 친화성 크로마토그래피 이론을 보았으니 실험실에서 IMAC 절차를 살펴보겠습니다.

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<div class="chapter_text" id="script_4">
IMAC에서 고정 된 위상은 이동 상 및 샘플의 혼합물에 직접 첨가 할 수 있으므로 태그된 단백질의 결합을 허용합니다. 이 슬러리는 다음 슬러리가 남아있는 동안 비 결합 화합물이 폐기물로 떨어지는 기둥에 부어됩니다. 슬러리 용기는 잔류 잔류 및 샘플을 수집하기 위해 헹굴되며, 이는 컬럼에 추가됩니다.
수지는 언바운드 성분이 자유롭게 흐르도록 교반됩니다. 워시 버퍼가 첨가되어 세척 버퍼를 플러시할 수 있습니다. 모든 언바운드 성분이 제거되면 폐기물을 대상 단백질을 수집하는 용기로 대체됩니다.
imidazole를 함유 하는 버퍼추가, 교반, 그리고 대상 분자를 바인딩 해제 하기 위해 휴식 허용. imidazole는 금속에 결합하여 태그가 지정된 단백질을 대체하고 방출합니다. 해방된 단백질이 수집되고, 이미다졸 단계는 총 수집을 보장하기 위해 반복된다. 샘플을 더 정화하기 위해 SEC는 분석 전에 샘플에서 실행할 수 있습니다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
이제 우리는이 두 기술의 이론과 절차를 보았으니 생화학 분야에서 적용되는 몇 가지 방법을 살펴 보겠습니다.
단백질을 정화하는 일반적인 이유는 질병에 있는 그들의 역할을 공부하는 것입니다. 낭포성 섬유증은 낭포성 섬유증 막 전도도 성 조절 단백질 또는 CFTR의 결함에 기인합니다. 효모에 있는 그의 꼬리표로 단백질을 성장한 후에, 친화력과 크기 배제 크로마토그래피는 단백질의 분리를 허용하고, 그 기능에 대한 연구 결과에 선행됩니다.
어떤 경우에, 폴리히스티딘 태그의 존재는 단백질의 구조를 바꿀 수 있습니다, 따라서 그것의 기능에 영향을 미치는. 또 다른 일반적인 태그는 말토스 결합 단백질 또는 MBP, 컬럼에 결합 하는 아밀로스에 바인딩됩니다. 그런 다음 말토세(Maltose)는 복합체를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 MBP는 SEC와 함께 갈라지고 제거하여 순수한 단백질을 생산할 수 있습니다.
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<div class="chapter_text" id="script_6">
크기 배제 및 친화성 크로마토그래피에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 그것은 기술의 이론을 커버, 일반적인 절차를 통해 갔다, 기술의 사용의 일부를 커버.
시청해 주셔서 감사합니다!
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In biochemistry, chromatography-based purification methods are employed to isolate compounds from a complex mixture. Two such methods used commonly by ...

"크로마토그래피"는 생체 분자의 특성과 활성을 결정하기 전에 필수적인 단계인 복잡한 혼합물에서 구성 요소를 분리하는 데 사용되는 광범위한 방법을 나타냅니다. 각 크로마토그래피 기법은 시료 매트릭스와 표적 화합물에 따라 분리를 위한 메커니즘이 다릅니다. 이 비디오는 생화학에 공통적인 두 가지 방법인 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피의 원리와 작동에 중점을 둡니다. 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC는 샘플에 있는 화합물의 크기를 기반으로 합니다. 샘플을 포함하는 이동상은 다공성 물질이 있는 컬럼, 즉 고정상(stationary phase)에 추가됩니다. 샘플의 분자는 3가지 범주 중 1가지에 속합니다. 너무 커서 공극으로 들어갈 수 없는 분자는 컬럼을 통해 가장 짧은 거리를 이동합니다. 이 "제외 한계"를 초과하는 분자량을 가진 모든 종은 동시에 컬럼을 종료합니다. 공극에 자유롭게 들어갈 수 있을 만큼 작은 분자는 가장 오래 유지되고 함께 컬럼을 빠져나옵니다. 완전한 기공 진입을 허용하는 분자량은 "투과 한계"입니다. 이러한 한계 사이의 분자만이 서로 분리될 것인데, 이는 그들이 공극 안팎으로 확산되는 데 다양한 시간을 소비하기 때문입니다. 더 작은 분자는 고정상에서 더 많은 시간을 보내기 때문에 컬럼에 더 오래 머무르는 반면, 이 한계 내의 더 큰 분자는 더 일찍 빠져 나옵니다. 1-2 크기의 분자량은 이러한 한계 내에 속합니다. 칼럼은 이것을 염두에두고 선택되거나, 원하는 화합물의 넓은 범위가있는 경우 여러 칼럼을 직렬로 사용할 수 있습니다. SEC 이론을 살펴보았으니, 이제 SEC가 어떻게 수행되는지 살펴보자. SEC 절차를 시작하려면 컬럼을 탈이온수 및 크로마토그래피 완충액으로 평형을 이루어야 합니다. 준비가 완료되면 샘플이 포함된 버퍼가 컬럼에 주입됩니다. 그런 다음 버퍼는 낮은 유속으로 밀어 넣습니다. 검출기는 컬럼에서 나오는 것을 모니터링하여 원하는 분석물의 존재를 확인합니다. 배제 한계를 초과하는 분자량을 가진 큰 분자는 동시에 컬럼을 빠져나갑니다. 컬럼의 작은 조각이 튜브에 수집됩니다. 각 분획은 겔 전기영동 또는 기타 분석 기술에 의해 표적 분자의 품질을 테스트합니다. 이제 단백질을 정제하는 가장 효율적인 방법 중 하나인 친화성 크로마토그래피(AC)에 대해 살펴보겠습니다. 많은 생체 분자는 특정 리간드에 선택적으로 결합하며, 이는 AC가 표적 특이적 리간드를 고정상에 부착하여 활용하는 특성입니다. 혼합물이 컬럼을 통해 흐르면 표적 분자가 리간드에 부착되고 나머지는 통과합니다. 혼합물이 컬럼을 통과한 후, 특이성에 따라 두 가지 용출 방법 중 하나를 통해 표적 분자를 수집할 수 있습니다. 생물 특이적 용리는 "정상적" 또는 "역-역할"을 갖는다고 말할 수 있습니다. 정상 역할 생물특이적 용리(bio-specific elution)에서는 표적 생체 분자와 결합하기 위해 부착된 리간드와 경쟁하는 물질이 추가됩니다. 역역할(reverse-role) 생물특이적 용리(biospecific elution)에서 제제는 부착된 리간드에 결합하기 위해 표적과 경쟁합니다. 두 번째 용출 유형인 비특이적 용리는 용액의 pH, 이온 강도 또는 극성을 변화시켜 표적-리간드 결합을 낮춥니다. 단백질이 고정될 수 있는 리간드에 결합하지 않는 경우, 단백질은 리간드에 결합하도록 조작된 짧은 펩타이드 서열인 "태그"를 포함하여 발현될 수 있습니다. 한 가지 종류는 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피(줄여서 "IMAC")로, 니켈 또는 코발트와 같은 접착된 금속 리간드가 변형된 단백질의 히스티딘 잔기에 결합합니다. 분자 생물학 기술을 통해 표적 단백질은 히스티딘의 이미다졸 측쇄를 통해 금속에 결합하는 폴리히스티딘 태그(polyhistidine-tag)라고 하는 반복적인 히스티딘 잔기로 생성됩니다. 일단 결합되면 단백질은 역역할 특이적 용출을 통해 유리 이미다졸로 수집될 수 있으며 나중에 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 친화성 크로마토그래피 이론을 살펴보았으니 이제 실험실에서 이루어지는 IMAC 절차를 살펴보겠습니다. IMAC에서는 이동상과 샘플의 혼합물에 고정상을 직접 첨가할 수 있어 his 태그가 지정된 단백질의 결합을 허용할 수 있습니다. 그런 다음 이 슬러리를 컬럼에 붓고 비결합 화합물은 폐기물로 떨어지고 슬러리는 남아 있습니다. 슬러리 용기를 헹구어 잔류 수지와 샘플을 수집하여 컬럼에 첨가합니다. 수지는 결합되지 않은 구성 요소가 자유롭게 흐르도록 교반됩니다. 추가된 세척 버퍼는 그것들을 씻어내는 데 도움이 됩니다. 결합되지 않은 모든 성분이 제거되면 폐기물을 대상 단백질을 수집하기 위한 용기로 교체합니다. 이미다졸을 함유하는 완충액을 첨가하고 교반한 후 그대로 두어 표적 분자의 결합을 해제합니다. 이미다졸은 금속에 결합하여 태그가 지정된 단백질을 대체하고 방출합니다. 유리된 단백질을 수집하고 이미다졸 단계를 반복하여 전체 수집을 보장합니다. 시료를 추가로 정제하기 위해 분석 전에 시료에 대해 SEC를 실행할 수 있습니다. 지금까지 이 두 가지 기법의 이론과 절차를 살펴보았으니, 이제 이 두 가지 기법이 생화학 분야에 적용되는 몇 가지 방법을 살펴보자. 단백질을 정제하는 일반적인 이유는 질병에서 단백질의 역할을 연구하기 위해서입니다. 낭포성 섬유증은 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절 단백질(CFTR)의 결함으로 인해 발생합니다. 효모에서 his 태그로 단백질을 성장시킨 후, 친화력과 크기 배제 크로마토그래피는 모두 단백질을 분리한 다음 그 기능에 대한 연구를 가능하게 합니다. 어떤 경우에는 폴리히스티딘 태그의 존재가 단백질의 구조를 변화시켜 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 또 다른 일반적인 태그는 맥아당 결합 단백질 또는 MBP로, 컬럼에서 결합된 아밀로스에 결합합니다. 그런 다음 맥아당을 사용하여 복합체를 방출합니다. 그런 다음 MBP를 절단하고 SEC로 제거하여 원하는 순수 단백질을 생산할 수 있습니다. 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 그것은 기술의 이론을 다루고, 일반적인 절차를 검토하고, 기술의 일부 용도를 다루었습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

Education

교육

JoVE Science Education

Chemistry

화학

Biochemistry

생화학

protein purification with sec and imac

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC.

Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A sample moves through a column packed with porous beads, which make up the stationary phase. Large molecules that cannot enter the pores travel the shortest path and leave first. Smaller molecules enter the pores, spend more time in the column, and leave later. Molecules between the exclusion limit and the permeation limit can be separated from each other, while molecules above or below those limits exit together.

The SEC procedure begins with equilibration of the column using deionized water and chromatography buffer. Sample-containing buffer is then injected, and the liquid is pushed through at a low flow rate. A detector watches what comes out of the column, and fractions are collected in tubes. These fractions can then be checked for the target molecule by gel electrophoresis or other analytical methods.

Affinity chromatography, or AC, uses the fact that many biomolecules bind selectively to certain ligands. In this method, a target-specific ligand is attached to the stationary phase. As the mixture passes through the column, the target binds to the ligand while the rest flows through. The target can then be released by biospecific elution, which may use a competing agent in normal-role or reverse-role form, or by nonspecific elution, which changes pH, ionic strength, or polarity.

If a protein does not naturally bind to an immobilized ligand, it can be engineered with a tag. A common example is a polyhistidine tag, or his-tag. In immobilized metal ion affinity chromatography, nickel or cobalt on the column binds to histidine residues through the imidazole side chain. The tagged protein is then released with free imidazole by reverse-role specific elution and can be used in downstream applications.

The IMAC procedure begins by mixing the stationary phase with the sample so the his-tagged protein can bind. The slurry is poured into the column, and unbound material drains to waste. The resin is rinsed into the column, stirred, and washed to remove leftover unbound components. After that, a container is placed to collect the target protein, and imidazole buffer is added to release it. The imidazole binds the metal, displaces the tagged protein, and the collected step may be repeated to improve recovery. For further cleanup, SEC can be run before analysis.

These purification methods are useful in biochemical and biomedical research. One example is cystic fibrosis research, where the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR, is grown with a his-tag in yeast and then isolated with affinity and size-exclusion chromatography. In some cases, a polyhistidine tag can change protein structure and affect function. Another tag used in protein work is maltose-binding protein, or MBP, which binds amylose in a column and is released with maltose. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the desired pure protein.

Protein Purification with SEC and IMAC

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

이 컬렉션은 선호도 크로마토그래피와 같은 일반적으로 사용되는 정제 방법과 MALDI-TOF와 같은 분석 방법을 제공합니다. 또한, 비디오는 공동 면역 침전 및 대사 라벨링과 같은 생체 분자 상호 작용 및 기능을 평가하는 방법을 선보이고 있습니다.

Explore how size-exclusion chromatography and IMAC separate proteins by size or binding, and see how tagged proteins are purified for research.

Protein Purification with SEC and IMAC | JoVE K12

Overview

Size-Exclusion Chromatography

Operation of Size-Exclusion Chromatography

Affinity Chromatography

Operation of Affinity Chromatography

Applications

Summary

What is Photosynthesis?

Photosynthesis is a multipart, biochemical process that occurs in plants as well as in some bacteria. It captures carbon dioxide and solar energy to ...

Light as Energy

The energy required to carry out photosynthesis is light&#8212; typically electromagnetic radiation from the sun. The range of all possible wavelengths is ...

Anatomy of Chloroplasts

Green algae and plants, including green stems and unripe fruit, harbor chloroplasts&mdash;the vital organelles where photosynthesis takes place. In ...

Photosystem II

The multi-protein complex photosystem II (PS II) harvests photons and transfers their energy through its bound pigments to its reaction center, and ...

Photosystem I

Although structurally similar to photosystem II (PSII), photosystem I (PSI) is has a different electron supplier and electron acceptor.
Both these ...

The Calvin Cycle

Overview

Oxygenic photosynthesis converts approximately 200 billion tons of carbon dioxide (CO2) annually to organic compounds and produces approximately ...

C4 Pathway and CAM

Most plants use the C3 pathway for carbon fixation. However, some plants, such as sugar cane, corn, and cacti that grow in hot conditions, use alternative ...

the-z-scheme-of-electron-transport-in-photosynthesis

The Z-Scheme of Electron Transport in Photosynthesis

The light reactions of photosynthesis assume a linear flow of electrons from water to NADP+. During this process, light energy drives the splitting of ...

Photosynthesis

Autotrophs

Almost all living organisms on Earth depend on photosynthesis, which is the process that converts sunlight energy into a simple sugar called ...

Plant Pigment Chromatography and Floating Leaf Discs in a Vacuum
ExpandOn the day before the experiment, fill a container with water.
Place the spinach ...

Plant Pigment Chromatography
ExpandNOTE: In this experiment you will separate pigments from spinach leaves using chromatography paper. Individual pigments ...

First Law of Thermodynamics

The First Law of Thermodynamics states that energy cannot be created or destroyed, only transformed. This can be demonstrated within a classic food web ...

Photosystems

Photosystems are multiprotein complexes that form the functional units of photosynthesis in plants, algae, and cyanobacteria. They are found embedded in ...

An Introduction to Cell Metabolism

In cells, critical molecules are either built by joining together individual units like amino acids or nucleotides, or broken down into smaller ...

Reconstitution of Membrane Proteins

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

Use a model to illustrate how photosynthesis transforms light energy into stored chemical energy.

HS-LS1-5.

Macromolecules

Biomolecules
Organisms contain a wide variety of organic molecules with numerous functions which depend on the chemical structures and properties of these ...

Solution Preparation
ExpandCAUTION: It is important to always use care when handling reagents. For example, iodine will stain clothes and skin so wear ...

Identifying Macromolecules with Indicator Solutions
ExpandHYPOTHESES: In this activity, the experimental hypothesis might be that the addition of an ...

Introduction to Carbohydrates

Carbohydrates, proteins, and fats are the primary macronutrients in the human diet. However, carbohydrates are the most favored source of energy in the ...

Carbohydrate Metabolism

Sugars as Energy Storage Molecules

Chemistry of Carbohydrates

Carbohydrates are an essential part of the diet in humans and animals. Grains, fruits, and vegetables are natural sources of carbohydrates that provide ...

Oligosaccharide Assembly

Protein glycosylation starts in the ER lumen and continues in the Golgi apparatus. Glycosyltransferases catalyze the addition of sugar molecules or ...

What are Lipids?

lipid-derived-compounds-in-the-human-body

Lipid-derived Compounds in the Human Body

Fats and lipids are crucial components in the human body. Some lipid-derived compounds, such as fat-soluble vitamins, eicosanoids, lipoproteins, and ...

Fats as Energy Storage Molecules

Structure of Lipids

Lipids include a diverse group of compounds that are largely nonpolar in nature. This is because they are hydrocarbons that include mostly nonpolar ...

Proteins and Amino Acids

Overview

Proteins are chains of amino acids that are connected by peptide bonds and folded into a 3-dimensional structure. The side chains of individual ...

Amino acids

Amino acids are the monomers that comprise proteins. Each amino acid has the same fundamental structure, which consists of a central carbon atom, or the ...

Peptide Bonds

A peptide bond covalently attaches amino acids through a dehydration reaction. One amino acid&#39;s carboxyl group and another amino acid&#39;s amino ...

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

Conditions on Early Earth

Around 4 billion years ago, oceans began to condense on earth while volcanic eruptions released nitrogen, carbon dioxide, methane, ammonia, and hydrogen ...

ATP and Macromolecule Synthesis

Biological macromolecules are organic compounds, predominantly composed of carbon atoms. The carbon atoms are covalently bonded with hydrogen, oxygen, ...

Dietary Connections

In biological systems, most metabolic pathways are interconnected. The cellular respiration processes that convert glucose to ATP&#8212;such as ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

Overview of Nitrogen Metabolism

Nitrogen is a very important element for life because it is a major constituent of proteins and nucleic acids. It is a macronutrient, and in nature, it is ...

Compounds Essential to Human Function

The human body is composed of cells that are fundamentally made up of several different molecules. These molecules are essential to carry out all ...

an-introduction-to-molecular-developmental-biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

Molecular signals play a major role in the complex processes occurring during embryonic development. These signals regulate activities such as cell ...

Dehydration Synthesis

Dehydration synthesis (also called a condensation reaction) is the chemical process in which two molecules covalently link together to form a new ...

an-introduction-to-saccharomyces-cerevisiae

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

All living organisms on Earth are directly or indirectly dependent on photosynthesis. It is the only biological process that can capture energy from ...

an-overview-of-alkenone-biomarker-analysis-for-paleothermometry

An Overview of Alkenone Biomarker Analysis for Paleothermometry

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
Throughout this series of videos, natural samples were extracted and ...

an-introduction-to-caenorhabditis-elegans

An Introduction to Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a microscopic, soil-dwelling roundworm that has been powerfully used as a model organism since the early 1970&rsquo;s.  It was ...

An Overview of Epigenetics

Since the early days of genetics research, scientists have noted certain heritable phenotypic differences that are not due to differences in the ...

An Introduction to Cell Death

Necrosis, apoptosis, and autophagic cell death are all manners in which cells can die, and these mechanisms can be induced by different stimuli, such as ...

An Overview of Gene Expression

Gene expression is the complex process where a cell uses its genetic information to make functional products. This process is regulated at multiple ...

An Introduction to Cell Division

Cell division is the process by which a parent cell divides and gives rise to two or more daughter cells. It is a means of reproduction for single-cell ...

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

an-introduction-to-cell-motility-and-migration

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

an-introduction-to-cellular-and-molecular-neuroscience

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

An Overview of Genetics and Disease

Many human diseases are associated with mutations or variations in genetic sequences. Some of these genetic variants are heritable, passed down from ...

an-introduction-to-developmental-genetics

An Introduction to Developmental Genetics

Development is the complex process through which a single-celled embryo transforms into a multicellular organism. Developmental processes are guided by ...

an-overview-of-bgdgt-biomarker-analysis-for-paleoclimatology

An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

Annexin V and Propidium Iodide Labeling

Staining with annexin V and propidium iodide (PI) provides researchers with a way to identify different types of cell death&#8212;either necrosis or ...

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

Construct and revise an explanation based on evidence for how carbon, hydrogen, and oxygen from sugar molecules may combine with other elements such as nitrogen, sulfur, and phosphorus to form amino acids and other carbon-based molecules.

Protein Purification with SEC and IMAC

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