Name: protein interaction capture methods in cells
Uploaded: 2023-04-30T06:31:42.000Z
Duration: 8 min 8 s
Channel: JoVE

K12 Standards

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Chemical Reactions

HS-PS1-5.

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

공동 면역 침전 (CoIP) 및 풀다운 분석은 안정적인 단백질 단백질 상호 작용을 식별하는 밀접하게 관련된 방법입니다. 이러한 방법은 면역 침전과 관련이 있으며, 이는 결합되지 않은 단백질로부터 항체에 결합된 표적 단백질을 분리하는 방법이다. CoIP에서, 항체 결합 단백질 자체는 항체와 결합하지 않는 다른 단백질에 묶여 있으며, 이것은 단백질-단백질 복합체를 보존하는 분리 과정에 선행된다. 풀다운 에세이의 차이점은 선호도 태그가 달린 미끼 단백질이 항체를 대체하고 친화 성 염색체가 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용된다는 것입니다.
이 비디오는 CoIP, 풀다운 에세이 및 실험실에서의 구현에 대해 설명합니다. 결합된 단백질을 정화하고 분석하는 데 사용되는 시약, 장치 및 계측기를 포함하여 각 기술에 대한 단계별 프로토콜이 적용됩니다. 또한, 이 비디오의 적용 섹션은 myxovirus 단백질이 인플루엔자 뉴클레오단백질을 억제하는 방법, 풀다운 분석법을 통해 칼모둘린에서 칼슘 이온의 역할에 대한 조사, 과도 단백질 상호 작용을 특성화하기 위한 수정된 풀다운 분석 등을 연구하는 절차를 설명합니다.

면역침하 및 풀다운 분석

공동 면역 침전 (CoIP) 및 풀다운 분석은 안정적인 단백질 단백질 상호 작용을 식별하는 밀접하게 관련된 방법입니다. 이러한 방법은 면역 침전과 관련이 있으며, 이는 결합되지 않은 단백질로부터 항체에 결합된 표적 단백질을 분리하는 방법이다. CoIP에서, 항체 결합 단백질 자체는 항체와 결합하지 않는 다른 단백질에 묶여 있으며, 이것은 단백질-단백질 복합체를 보존하는 분리 과정에 선행된다. 풀다운 에세이의 차이점은 선호도 태그가 달린 미끼 단백질이 항체를 대체하고 친화 성 염색체가 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용된다는 것입니다.
이 비디오는 CoIP, 풀다운 에세이 및 실험실에서의 구현에 대해 설명합니다. 결합된 단백질을 정화하고 분석하는 데 사용되는 시약, 장치 및 계측기를 포함하여 각 기술에 대한 단계별 프로토콜이 적용됩니다. 또한, 이 비디오의 적용 섹션은 myxovirus 단백질이 인플루엔자 뉴클레오단백질을 억제하는 방법, 풀다운 분석법을 통해 칼모둘린에서 칼슘 이온의 역할에 대한 조사, 과도 단백질 상호 작용을 특성화하기 위한 수정된 풀다운 분석 등을 연구하는 절차를 설명합니다.
<div class="chapter_text" id="script_0">
단백질 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을 합니다. 단백질 단백질 상호 작용의 대다수 및 그들의 생물학 효력은 아직 확인되지 않았습니다. 공존면역침전, 또는 CoIP, 및 풀다운 분석법은 안정적인 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 두 가지 밀접한 관련 방법이다. 이 비디오는 두 가지 에세이의 원칙, 일반적인 실험실 절차 및 이러한 기술의 응용 프로그램을 다룹니다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
CoIP 및 풀다운 분석법은 면역 침전의 이체이며, 복잡한 용액으로부터 단백질 종을 선택적으로 격리시키는 방법입니다. 면역 침전 실험에서, 표적 단백질에 특이적인 항체는 시료에 있는 그 표적으로 면역 복합체를 형성하는 것이 허용됩니다. 복합체는 고체 지지대에서 포획되고, 전형적으로 단백질 A는 세파로즈 비드에 묶여 있다. 포획되지 않은 모든 단백질은 원심분리 단계에 의해 제거됩니다. 단백질은 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시키는 데 끓여 서 항체 및 고체 지지에서 방출된다.
동면역침전은 그대로 단백질 복합체가 고체 지지에 포획된다는 점을 제외하고는 동일한 방식으로 수행된다. 항체는 표적 단백질에 결합하며, 이는 차례로 항체에 의해 표적화되지 않은 다른 단백질에 결합된다. 면역 침전에서와 같이, 단백질 복합체는 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 감소시키는 끓임으로써 항체 및 고체 지지로부터 방출된다.
풀다운 분석체는 항체와 는 달리 "미끼" 단백질의 사용에서만 다른 공동 면역 침전과 유사합니다. 분자 생물학 기술을 통해 이 미끼 단백질은 일련의 히스티딘 잔류물과 같은 친화성 태그로 설계되었습니다. 이러한 친화성 태그는 "크로마토그래피 기반 생체 분자 분리"에 설명되어 있습니다. 단백질은 태그에 특정 고정 된 친화성 리간드에 캡처됩니다. 그 때 붙잡힌 단백질은 "미끼"로 복합체를 형성하는 단백질을 포함하는 견본으로 인큐베이션됩니다. 단백질 복합체는 "미끼" 단백질에 대한 태그에 특이적인 경쟁적인 별립을 포함하는 용액으로 세척함으로써 친화성 지원으로부터 방출된다. 풀다운 분석은 공동 면역 강수량에 의해 예측된 단백질 상호 작용을 확인하고, 알려지지 않은 단백질 상호 작용을 발견하는 데 유용합니다.
이제 공동 면역 강수량 및 풀다운 분석의 원리가 논의되었으므로 실험실 절차를 살펴 보겠습니다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
먼저 공동 면역 침전을 논의해 봅시다. 일련의 마이크로퍼지 튜브에, PBS 버퍼, 및 항체에 결합하는 수지 단백질 복합체인 단백질 A-sepharose의 50% 용액이 추가된다. 미세 분리 튜브는 적절한 분포를 보장하기 위해 회전한 다음 수지를 추가 PBS 버퍼로 세척합니다. 세포 용액, 원하는 단백질을 함유하고, 항체의 2 μg가 마이크로퍼지 튜브에 첨가되고, 혼합물은 4°C에서 1시간 동안 회전된다. 구슬은 원심분리에 의해 펠릿화되고, 상류체는 폐기되고, 비결합 단백질을 제거하기 위해 완충제로 세 번 재세척된다. 항체-단백질 복합체를 함유하는 구슬은 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시키고, 항체로부터 복합체를 제거하고 SDS-PAGE 및 면역블로팅에 의한 분석을 위한 것이다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
이제 우리는 풀다운 에세이에 대한 절차를 논의 할 것이다 : "미끼"단백질은 적절한 친화성 태그와 플라스미드로 표현된다. 로그 상 성장에 도달 한 후, 세포는 lysed, 다음 원심 분리. 비틴 태그가 붙은 "미끼" 단백질을 포착하는 염혈막-세파로즈 구슬은 마이크로퍼지 튜브로 피펫처리됩니다. 구슬은 원심 분리되고 상부는 포부에 의해 조심스럽게 제거됩니다. 그런 다음 구슬을 버퍼, 원심 분리 및 상부제거로 세척합니다.
"미끼" 단백질에 대한 친화력을 가한 putative "prey" 단백질을 함유한 세포는 원심분리에 의해 수확됩니다. 상피체는 수지를 포함하는 마이크로퍼지 튜브에 첨가되고, 셰이커에서 3시간 동안 4°C에서 배양한다. 수지는 원심 분리되고, 상피가 제거되고, 수지는 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척됩니다. 용출 버퍼는 수지에 첨가되고, 혼합물은 셰이커에 30 분 동안 실온에서 배양된다. 수지는 원심분리되고, 원하는 복합체를 포함하는 상피제는 면역블로팅에 의해 분석된다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
이제 절차를 검토한 결과, 공동 면역 침전 및 풀다운 분석의 유용한 응용 분야 중 일부를 살펴보겠습니다.
공동 면역 침전은 효소의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 유용할 수 있습니다. Myxovirus-또는 Mx-, 내성 단백질은 기전이 제대로 이해되지 않는 인플루엔자 A를 포함한 광범위한 바이러스를 억제합니다. 공존성전성은 마우스 Mx1 단백질과 인플루엔자 뉴클레오단백질 간의 상호작용을 연구하기 위해 사용되었다.
풀다운 분석에는 세포 환경으로부터 신호를 전달하는 단백질인 두 번째 메신저의 효과를 연구하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그(것)들은 다중 단백질이 환경 단서에 응하여 상호 작용하는 신호 통로의 분대입니다. 칼슘 이온은 칼모둘린에 결합하여 이차 메신저 역할을 하며, 이는 다양한 단백질에 결합하여 많은 유형의 생물학적 반응을 중재합니다. 칼슘이 없으면 단백질은 칼모둘린에 결합할 수 없습니다. 탈당 분석법은 칼슘 이온의 존재 또는 부재에서 칼모둘린에 결합하는 단백질의 능력을 테스트하기 위하여 실시되었습니다.
공동 면역 침전 및 풀다운 분석은 일반적으로 안정적이거나 강한 단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되지만 일시적인 분석은 아닙니다. 풀다운 에세이의 최근 개발, HaloTag, 일시적인 단백질 상호 작용의 연구를 단순화했다; HaloTag는 유전적으로 인코딩된 단백질 융합 태그로, 관심 있는 단백질에 융합되어 할랄카 고체 지지체로 화학적으로 반응할 수 있습니다. 기능적 분석이 바람직한 경우, 단백질 복합체는 태그를 뺀 다음 담배 에칭 바이러스 프로테아제로 인큐베이팅하여 격리될 수 있습니다.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
당신은 단지 공동 면역 침전 및 풀다운 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 두 가지 방법의 원리, 일반 실험실 절차 및 일부 응용 분야에 대해 설명했습니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
</div>

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

단백질과 단백질의 상호작용은 다양한 생물학적 기능에서 중요한 역할을 합니다. 단백질과 단백질의 상호작용과 그 생물학적 영향의 대부분은 아직 확인되지 않았습니다. Co-immunoprecipitation(CoIP) 및 풀다운 분석은 안정적인 단백질-단백질 상호 작용을 식별하기 위해 밀접하게 관련된 두 가지 방법입니다. 이 비디오에서는 두 가지 분석의 원리, 일반적인 실험실 절차 및 이러한 기술의 응용 프로그램을 다룹니다. CoIP 및 풀다운(pull-down) 분석은 복잡한 용액에서 단백질 종을 선택적으로 분리하는 방법인 면역침전(immunoprecipitation)의 변형입니다. 면역침전 실험에서는 표적 단백질에 특이적인 항체가 샘플에서 해당 표적과 면역 복합체를 형성할 수 있습니다. 그런 다음 복합체는 고체 지지체, 일반적으로 단백질 A가 세파로스 비드에 결합되어 포획됩니다. 포획되지 않은 단백질은 원심분리 단계로 제거합니다. 그런 다음 단백질은 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 감소시켜 끓여서 항체 및 고체 지지체에서 방출됩니다. 동시 면역침전은 온전한 단백질 복합체가 고체 지지체에 포획된다는 점을 제외하고는 동일한 방식으로 수행됩니다. 항체는 표적 단백질에 결합하고, 이 단백질은 항체가 표적화하지 않은 다른 단백질에 결합합니다. 면역침전에서와 같이, 단백질 복합체는 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시켜 끓임으로써 항체와 고체 지지체로부터 방출됩니다. 풀다운(pull-down) 분석은 동시 면역침전(co-immunoprecipitation)과 유사하며, 항체와 반대되는 "미끼" 단백질을 사용한다는 점만 다릅니다. 분자 생물학 기술을 통해 이 미끼 단백질은 일련의 히스티딘 잔기와 같은 친화성 태그로 설계되었습니다. 이러한 친화성 태그는 "크로마토그래피 기반 생체 분자 분리"에 설명되어 있습니다. 그런 다음 단백질은 태그에 특이적인 고정된 친화성 리간드에 포착됩니다. 그런 다음 포획된 단백질은 "미끼"와 복합체를 형성하는 단백질이 포함된 샘플로 배양됩니다. 단백질 복합체는 "미끼" 단백질의 태그에 특이적인 경쟁력 있는 분석물이 포함된 용액으로 세척하여 친화력 지원에서 방출됩니다. 풀다운(pull-down) 분석은 동시 면역침전(co-immunoprecipitation)에 의해 예측된 단백질 상호작용을 확인하고 알려지지 않은 단백질 상호작용을 발견하는 데 유용합니다. 이제 co-immunoprecipitation과 pull-down assay의 원리에 대해 논의했으니, 이제 이들의 실험실 절차를 살펴보도록 하겠습니다. 먼저 동시 면역침전에 대해 논의해 보겠습니다. 일련의 마이크로분리관에 PBS 완충액과 항체에 결합하는 수지-단백질 복합체인 단백질 A-세파로스의 50% 용액이 추가됩니다. 마이크로분리관은 적절한 분포를 보장하기 위해 회전한 다음 수지를 추가 PBS 버퍼로 세척합니다. 목적하는 단백질을 함유하는 세포 용해물, 및 2μg의 항체를 마이크로분리 튜브에 첨가하고, 혼합물을 4μC에서 1시간 동안 회전시킨다. 비드는 원심분리에 의해 펠릿화되고, 상등액은 폐기되며, 비드는 완충액으로 세 번 재세척되어 비결합 단백질을 제거합니다. 항체-단백질 복합체를 포함하는 비드는 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 감소시키고, 항체에서 복합체를 제거하고, SDS-PAGE 및 면역 블로팅에 의한 분석을 위한 것입니다. 이제 풀다운(pull-down) 분석 절차에 대해 논의하겠습니다: "미끼" 단백질은 적절한 친화성 태그가 있는 플라스미드에서 발현됩니다. 로그 위상 성장에 도달한 후 세포를 용해한 다음 원심분리합니다. 비오틴 태그가 붙은 "미끼" 단백질을 포획하는 부유 스트렙타비딘-세파로스 비드를 마이크로분리 튜브에 피펫으로 주입합니다. 그런 다음 비드를 원심분리하고 흡인에 의해 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 비드를 완충액으로 세척하고 원심분리하며 상층액을 제거합니다. "미끼" 단백질에 대한 친화력을 가진 것으로 추정되는 "먹이" 단백질을 포함하는 세포는 원심분리에 의해 수확됩니다. 그런 다음 상등액을 수지를 포함하는 마이크로분리관에 첨가하고 4°C에서 배양합니다. C를 셰이커에서 3시간 동안 사용합니다. 그런 다음 수지를 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 수지를 세척하여 비결합 단백질을 제거합니다. 용출 완충액을 수지에 첨가하고 혼합물을 셰이커에서 30분 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 수지를 원심분리하고 원하는 복합체를 포함하는 상등액을 면역블로팅으로 분석합니다. 지금까지 절차를 검토했으므로 이제 co-immunoprecipitation과 pull-down assay의 유용한 응용 분야에 대해 알아보겠습니다. 동시 면역침전은 효소의 작용 기전을 더 잘 이해하는 데 유용할 수 있습니다. 점액소 바이러스 또는 Mx- 내성 단백질은 인플루엔자 A를 포함한 광범위한 바이러스를 억제하는데, 이 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 마우스 Mx1 단백질과 인플루엔자 핵단백질 간의 상호 작용을 연구하기 위해 공동 면역침전을 사용했습니다. 풀다운(pull-down) 분석법은 세포 환경의 신호를 전달하는 단백질인 제2의 전달자(second messenger)의 효과를 연구하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다. 이들은 여러 단백질이 환경적 신호에 반응하여 상호 작용하는 신호 경로의 구성 요소입니다. 칼슘 이온은 칼모듈린에 결합하여 2차 전달자로 작용하며, 칼모듈린은 다양한 단백질에 결합하여 다양한 유형의 생물학적 반응을 매개합니다. 칼슘이 없으면 단백질이 칼모듈린에 결합할 수 없습니다. 칼슘 이온의 존재 또는 부재 시 단백질이 칼모듈린에 결합하는 능력을 테스트하기 위해 풀다운 분석이 수행되었습니다. Co-immunoprecifront 및 pull-down assay는 일반적으로 안정적이거나 강한 단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되지만 일시적인 상호 작용은 그렇지 않습니다. 풀다운 분석법의 최근 개발인 HaloTag는 일시적인 단백질 상호 작용에 대한 연구를 단순화했습니다. HaloTag는 유전적으로 암호화된 단백질 융합 태그로, 관심 단백질에 융합되어 할로알칸 고체 지지체와 화학적으로 반응할 수 있습니다. 기능 분석이 필요한 경우, 태그를 뺀 단백질 복합체 전체를 담배 에칭 바이러스 프로테아제로 배양하여 분리할 수 있습니다. 방금 co-immunoprecipitation 및 pull-down assay에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이 비디오는 두 가지 방법의 원리, 일반적인 실험실 절차 및 일부 응용 분야에 대해 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

Education

교육

JoVE Science Education

Chemistry

화학

Biochemistry

생화학

protein interaction capture methods in cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody.

In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the antibody does not recognize. The intact protein complex is collected on a solid support, such as protein A on sepharose beads, so the interaction is preserved during separation. In pull-down assays, the bait protein is tagged instead of using an antibody. The tagged bait is captured by affinity chromatography and used to isolate the proteins that bind to it.

The CoIP procedure begins with PBS buffer and protein A-sepharose in microfuge tubes. The tubes are rotated, washed, and then mixed with cell lysate and about 2 micrograms of antibody. After 1 hour at 4 degrees Celsius, the beads are centrifuged, washed three times, and placed in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer. The released proteins are then analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting.

The pull-down procedure uses a bait protein expressed with an affinity tag, such as a series of histidine residues or a biotin tag. After the cells reach log-phase growth, they are lysed and centrifuged. Streptavidin-sepharose beads can capture the biotin-tagged bait, and the beads are then washed before the putative prey protein is added. The mixture is incubated at 4 degrees Celsius for 3 hours on a shaker, washed again, and eluted with buffer. The final complex is analyzed by immunoblotting.

These methods are useful for confirming predicted protein interactions and for finding unknown ones. CoIP has been used to study how mouse Mx1 protein interacts with influenza nucleoprotein, which helps explain the action of myxovirus resistance proteins against influenza A. Pull-down assays have also been used to test how calcium ions affect calmodulin binding, since calmodulin binds many proteins only when calcium is present. For transient protein interactions, a modified pull-down approach using HaloTag can help, and tobacco etch virus protease can remove the tag if functional analysis is needed.

Protein Interaction Capture Methods in Cells

protein-interaction-capture-methods-in-cells

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

이 컬렉션은 선호도 크로마토그래피와 같은 일반적으로 사용되는 정제 방법과 MALDI-TOF와 같은 분석 방법을 제공합니다. 또한, 비디오는 공동 면역 침전 및 대사 라벨링과 같은 생체 분자 상호 작용 및 기능을 평가하는 방법을 선보이고 있습니다.

Learn how CoIP and pull-down assays capture protein-protein interactions, from bead-based lab steps to examples with influenza proteins and calmodulin.

Protein Interaction Capture Methods in Cells | JoVE K12

Life Science

Structure and Function

HS-LS1-2.

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Overview

Principles of Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Protocol for Co-Immunoprecipitation

Protocol for Pull-Down Assays

Applications

Summary

The Periodic Table

As early chemists discovered more elements, they realized that various elements could be grouped by their similar chemical behaviors. One such grouping ...

Alkali Metals

Group 1 elements are soft and shiny metallic solids. They are malleable, ductile, and good conductors of heat and electricity. The melting points of the ...

Halogens

Group 17 elements, known as halogens, are nonmetals. At room temperature, fluorine and chlorine are gases, bromine is a liquid, and iodine a solid. ...

Noble Gases


The elements in group 18 are noble gases (helium, neon, argon, krypton, xenon, and radon). They earned the name &ldquo;noble&rdquo; because they were ...

Classifying Matter by State

Chemistry is the study of matter and the changes it undergoes. Matter is anything that has mass and occupies space. Matter is all around us; the air, ...

Classifying Matter by Composition

Matter: Pure Substances and Mixtures
According to its composition, the matter can be classified into two broad categories &mdash; pure substances and ...

physical-and-chemical-properties-of-matter

Physical and Chemical Properties of Matter

The characteristics that enable us to distinguish one substance from another are called properties.

Physical Properties of Matter

A physical property is ...

Types of Chemical Bonds

Chemical bonding theories were pioneered by American chemist Gilbert&#xA0;N. Lewis. He developed a model called the Lewis model to explain the type and ...

Lewis Symbols and the Octet Rule

Chemical bonds are complex interactions between two or more atoms or ions, which reduce the potential energy of the molecule. Gilbert N. Lewis developed a ...

Ionic Bonding and Electron Transfer

Ions are atoms or molecules bearing an electrical charge. A cation (a positive ion) forms when a neutral atom loses one or more electrons from its valence ...

The Born-Haber Cycle

Lattice Energy&#xA0;

An ionic compound is stable because of the electrostatic attraction between its positive and negative ions. The lattice energy of a ...

trends-in-lattice-energy-ion-size-and-charge

Trends in Lattice Energy: Ion Size and Charge

An ionic compound is stable because of the electrostatic attraction between its positive and negative ions. The lattice energy of a compound is a measure ...

Covalent Bonding and Lewis Structures

Compared to ionic bonds, which results from the transfer of electrons between metallic and nonmetallic atoms, covalent bonds result from the mutual ...

Electronegativity

Whether a bond is nonpolar or polar covalent is determined by a property of the bonding atoms called electronegativity.&#xA0;

Electronegativity values of ...

Ionization Energy

The amount of energy required to remove the most loosely bound electron from a gaseous atom in its ground state is called its first ionization energy ...

bond-polarity-dipole-moment-and-percent-ionic-character

Bond Polarity, Dipole Moment, and Percent Ionic Character

Bond Polarity

The absolute value of the difference in electronegativity (&Delta;EN) of two bonded atoms provides a rough measure of the polarity to be ...

Electron Affinity

The electron affinity (EA) is the energy change for adding an electron to a gaseous atom to form an anion (negative ion).



This process can be either ...

lewis-structures-of-molecular-compounds-and-polyatomic-ions

Lewis Structures of Molecular Compounds and Polyatomic Ions

To draw Lewis structures for complicated molecules and molecular ions, it is helpful to follow a step-by-step procedure as outlined:


	Determine the ...

assembly-of-a-reflux-system-for-heated-chemical-reactions

Assembly of a Reflux System for Heated Chemical Reactions

Source: Laboratory of Dr. Philip Miller &#8212; Imperial College London
Many chemical experiments require elevated temperatures before any reaction is ...

Resonance

The Lewis structure of a nitrite anion (NO2&minus;) may actually be drawn in two different ways, distinguished by the locations of the N-O and N=O ...

conducting-reactions-below-room-temperature

Conducting Reactions Below Room Temperature

Source: Laboratory of Dr. Dana Lashley - College of William and Mary
Demonstration by: Matt Smith
When new bonds are formed in the course of a chemical ...

Formal Charges

In some cases, there are seemingly more than one valid Lewis structures for molecules and polyatomic ions. The concept of formal charges can be used to ...

Coordination Chemistry Complexes

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
Transition metals are found everywhere from vitamin ...

Exceptions to the Octet Rule

Many covalent molecules have central atoms that do not have eight electrons in their Lewis structures. These molecules fall into three categories:


	...

determining-rate-laws-and-the-order-of-reaction

Determining Rate Laws and the Order of Reaction

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
All chemical reactions have a specific rate defining the ...

Bond Energies and Bond Lengths

Stable molecules exist because covalent bonds hold the atoms together. The strength of a covalent bond is measured by the energy required to break it, ...

Determining the Empirical Formula

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams - SUNY College of Environmental Science and Forestry
Determining the chemical formula of a compound is at the heart ...

Bonding in Metals

Metallic bonds are formed between two metal atoms. A simplified model to describe metallic bonding has been developed by Paul Dr&#xFC;de called the ...

determining-the-solubility-rules-of-ionic-compounds

Determining the Solubility Rules of Ionic Compounds

Source: Laboratory of Dr. Neal Abrams &#8212; SUNY College of Environmental Science and Forestry
An ionic compound&#39;s solubility can be determined via ...

atomic-radii-and-effective-nuclear-charge

Atomic Radii and Effective Nuclear Charge

The elements in groups of the periodic table exhibit similar chemical behavior. This similarity occurs because the members of a group have the same number ...

Introduction to Catalysis

Source: Laboratory of Dr. Ryan Richards &#8212; Colorado School of Mines
Catalysis is among the most important fields of modern technology and presently ...

Ionic Radii

Ionic radius is the measure used to describe the size of an ion. A cation always has fewer electrons and the same number of protons as the parent atom; it ...

Introduction to Titration

Source: Laboratory of Dr. Yee Nee Tan &#8212; Agency for Science, Technology, and Research
Titration is a common technique used to quantitatively ...

Le Ch&#226;telier's Principle

Source: Laboratory of Dr. Lynne O&#39;Connell &#8212; Boston College
When the conditions of a system at equilibrium are altered, the system responds in ...

preparing-anhydrous-reagents-and-equipment

Preparing Anhydrous Reagents and Equipment

Source: Laboratory of Dr. Dana Lashley - College of William and Mary
Demonstrated by: Timothy Beck and Lucas Arney
Many reactions in organic chemistry are ...

Proton Exchange Membrane Fuel Cells

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
The United States consumes a large amount of energy &#8211; the current ...

Solutions and Concentrations

Source: Laboratory of Dr. Michael Evans &#8212; Georgia Institute of Technology
A solution is a homogeneous mixture containing some components in small ...

spectrophotometric-determination-of-an-equilibrium-constant

Spectrophotometric Determination of an Equilibrium Constant

Source: Laboratory of Dr. Michael Evans &#8212; Georgia Institute of Technology
The equilibrium constant, K, for a chemical system is the ratio of product ...

using-differential-scanning-calorimetry-to-measure-changes-in-enthalpy

Using Differential Scanning Calorimetry to Measure Changes in Enthalpy

Source: Laboratory of Dr. Terry Tritt &#8212; Clemson University
Differential Scanning Calorimetry (DSC) is a method of thermodynamic analysis based on ...

Schlenk Lines Transfer of Solvents

Source: Hsin-Chun Chiu and Tyler J. Morin, laboratory of Dr. Ian Tonks&#8212;University of Minnesota Twin Cities
Schlenk lines and high vacuum lines are ...

Construct and revise an explanation for the outcome of a simple chemical reaction based on the outermost electron states of atoms, trends in the periodic table, and knowledge of the patterns of chemical properties.

HS-PS1-2.

Chemical Equations

Chemical equations represent the identities and relative quantities of substances involved in a chemical reaction. The substances undergoing reaction are ...

Chemical Reactions in Aqueous Solutions

Chemical substances interact in many different ways. Certain chemical reactions exhibit common patterns of reactivity. Due to the vast number of chemical ...

Precipitation Reactions

In a precipitation reaction, aqueous solutions of soluble salts react to give an insoluble ionic compound &#x2013; the precipitate. The reaction occurs ...

Oxidation-Reduction Reactions

Oxidation&ndash;Reduction Reactions

Earth&rsquo;s atmosphere contains about 20% molecular oxygen, O2, a chemically reactive gas that plays an essential ...

Oxidation Numbers

In redox reactions, the transfer of electrons occurs between reacting species. Electron transfer is described by a hypothetical number called the ...

Acids, Bases and Neutralization Reactions

An acid-base reaction is one in which a hydrogen ion, H+, is transferred from one chemical species to another. Such reactions are of central importance to ...

Synthesis and Decomposition Reactions

Synthesis and decomposition are two types of redox reactions. Synthesis means to make something, whereas decomposition means to break something. The ...

Develop a model to illustrate that the release or absorption of energy from a chemical reaction system depends upon the changes in total bond energy.

HS-PS1-4.

Reaction Rate

The rate of reaction is the change in the amount of a reactant or product per unit time. Reaction rates are therefore determined by measuring the time ...

Measuring Reaction Rates

Polarimetry finds application in chemical kinetics to measure the concentration and reaction kinetics of optically active substances during a chemical ...

Apply scientific principles and evidence to explain how the rate of a physical or chemical change is affected when conditions are varied.

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards