DNA 분리 및 제한 효소 분석
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- 참고: 이 실험에서는 두 가지 실험 조건에서 DNA 분리를 수행합니다: 하나는 세제 SDS가 포함된 완충액을 사용하는 것이고 다른 하나는 세제가 없는 것입니다. 가설: 이 실험의 대체 가설은 세포막을 분해하는 강력한 음이온성 세제인 SDS를 사용하지 않고 준비한 샘플이 SDS로 준비된 샘플보다 더 적은 DNA를 생성한다는 것입니다. 이 실험의 귀무 가설은 두 샘플이 동일한 양의 DNA를 산출한다는 것일 수 있습니다.
- DNA 분리를 위한 조직 샘플 수집을 시작합니다. 여기에서 자신의 뺨 세포를 사용하게 됩니다. 아이스 캔디 스틱을 사용하여 약 30초 동안 뺨 안쪽을 긁어냅니다.중요: 통증을 유발하거나 피를 뽑을 정도로 세게 긁지 마십시오.
- 15mL 원추형 튜브에 깔때기를 배치합니다.
- 그런 다음 표시된 컵에 제공된 1 % 식염수 10mL를 삼키지 않고 입안에서 헹굽니다.
- 90초 동안 계속 휙휙 돌린 다음 뺨 세포가 포함된 식염수를 깔때기에 뱉어 원뿔형 튜브에 모입니다.
- 다음으로, 두 개의 빈 마이크로 원심분리기 튜브에 이니셜을 표시합니다.
- 두 트리트먼트를 구별하기 위해 튜브 중 하나를 +SDS로, 다른 튜브를 -SDS로 표시합니다.
- 그런 다음 볼 세포가 들어있는 식염수 1.5-2mL를 각 튜브에 추가합니다.
- 마이크로 원심분리기에서 튜브를 30초 동안 돌립니다.
- 마이크로 원심분리기에서 튜브를 제거하고 각 튜브의 바닥에 모인 세포를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 붓습니다.
- 뺨 세포가 포함된 식염수를 튜브에 더 많이 채우고 원심분리를 반복합니다.
- 모든 볼 세포가 수집될 때까지 +SDS와 -SDS 튜브 사이에 세포를 고르게 분배하도록 주의하면서 이 과정을 반복합니다.
- 다음으로, +SDS로 표시된 튜브에 SDS가 포함된 용해 완충액 1mL를 추가한 다음 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 그런 다음 -SDS로 표시된 튜브에 SDS가 없는 용해 완충액 1mL를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 그런 다음 각 튜브에 10 μL의 단백질 분해 효소 K를 첨가 한 다음 튜브를 56ºC 수조에 10 분 동안 조심스럽게 놓습니다.
- 10 분 후 수조에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 각 튜브에 100 μL의 2.5 M NaCl을 첨가합니다.
- 튜브를 단단히 닫고 여러 번 뒤집어 섞습니다.
- 다음으로, 하나의 15mL 원추형 튜브 하나를 +SDS로, 다른 하나를 -SDS로 표시합니다.
- 각 마이크로 원심분리기 튜브의 내용물을 해당 15mL 원추형 튜브에 붓습니다.
- 냉동고에서 100% 에탄올 10mL 분취 1개를 얻습니다.
- 원뿔형 튜브 중 하나를 비스듬히 잡고 100% 에탄올 1mL를 튜브에 천천히 분배하여 이미 튜브에 있는 액체 위에 층을 형성합니다.
- 두 번째 원추형 튜브에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 이제 두 튜브를 모두 살펴보십시오. 에탄올과 그 아래의 수성층의 계면에 존재하는 끈적한 침전물이 있어야 합니다. 이 끈적끈적한 물질에는 분리된 DNA가 포함되어 있습니다. 튜브 안의 DNA를 사진으로 찍고 공책에 관찰 내용을 명확하게 설명하고 그림을 그리십시오.
- 유리 교반 막대를 사용하여 + SDS 튜브에서 DNA를 집어 검사하십시오. -SDS 튜브에 대해 이 작업을 반복하여 관찰 내용을 다시 기록합니다. 튜브 중 하나가 다른 튜브보다 침전물이 더 많은 것처럼 보이는지, 그리고 왜 그럴 수 있는지 기록하십시오.
- 마지막으로 모든 액체 폐기물을 적절한 폐기물 용기에 버리고 모든 도구를 실험실의 적절한 위치로 되돌립니다.
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- 제한 효소의 작동 방식을 연구하려면 먼저 New England Biolabs 웹사이트로 이동하십시오: https://www.neb.com/
- 이 사이트에서 사용할 수 있는 리소스를 통해 연구원은 실험실에서 수행하기 전에 가상 실험을 실행할 수 있습니다. "도구 및 리소스"를 클릭하여 NEBcutter 도구를 찾아 프로그램을 엽니다.
- 검색 상자 오른쪽에서 "Viral + phage"라는 목록을 찾으십시오. 해당 목록에서 Lambda를 선택합니다. 이것은 당신이 소화하게 될 DNA의 이름입니다. 도구에서 "the sequence is"라고 표시되는 경우 선형 옵션을 선택하고 도구에서 "사용할 효소"라고 표시되는 경우 "NEB enzymes" 옵션을 선택합니다. 그런 다음 제출을 클릭합니다.
- 다음 페이지에는 람다 DNA의 전체 제한 맵이 표시됩니다. 이 제한 맵은 특정 효소가 사용될 경우 어떤 일이 발생할지 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 "Main options" 제목 아래의 "Custom digest"를 클릭합니다.
- 효소 StuI를 검색하고 버퍼 2.1 또는 CS 버퍼에서 최적으로 작동한다는 점에 유의하십시오. StuI enzyme을 선택하고 digest(다이제스트)를 클릭합니다.
- 다음 창에서 "Main options"헤더 아래의 "View gel"을 클릭하십시오. pBR322-BstN1 분해물을 사용하여 가상 1% 겔을 실행하는 옵션을 선택합니다.
- 결과가 나타나면 스크린샷을 찍어 빈 문서에 붙여넣습니다.
- 그런 다음 NEBcutter 도구의 기본 페이지로 돌아가서 "새 사용자 정의 다이제스트"를 선택합니다.
- 이번에는 BsrGI 효소를 검색하고 버퍼 2.1 또는 버퍼 3.1에서 최적으로 수행된다는 점에 유의하십시오. 효소를 선택하고 다이제스트를 클릭합니다.
- Main options 헤더에서 "View gel"을 클릭하고 pBR322-BstN1 다이제스트를 사용하여 가상 1% gel을 실행하는 옵션을 선택합니다.
- 결과의 스크린샷을 찍어 텍스트 문서에 저장합니다.
- 마지막으로 단일 다이제스트에서 StuI와 BsrGI를 함께 사용하여 이 단계를 반복합니다.
- 다시, 스크린 샷을 찍고 결과 젤을 저장하십시오.
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- 제한 효소 분해를 시작하기 전에 먼저 lambda DNA, NEB buffer 2.1, StuI 효소 및 BsrGI 효소의 분취량을 얼음 양동이에 넣고 이것을 작업 영역으로 가져갑니다.
- 튜브에 StuI로 라벨 붙이기 – 이것은 StuI 다이제스트를 포함합니다.
- BsrGI 다이제스트를 포함하기 위해 튜브를 BsrGI로 레이블합니다.
- 그런 다음 두 효소가 모두 함유 된 다이제스트를 포함하기 위해 튜브 S + B에 레이블을 붙입니다.
- 적절한 마이크로피펫터를 사용하여 표 1에 나열된 반응을 설정합니다:표 1을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
- 먼저 40μL의 물을 각 튜브에 피펫으로 넣습니다.
- 그런 다음 매번 새로운 피펫 팁을 사용하여 5 μL의 버퍼 2.1을 각 튜브와 피펫 위아래로 분배하여 혼합합니다.
- 다음으로 각 튜브에 4 μL의 람다 DNA를 추가 한 다음 각 효소 0.5 μL를 적절한 튜브에 피펫팅합니다.
- 마지막으로 각 튜브에 충분한 양의 물을 추가하여 총 부피를 최대 50 μL까지 가져옵니다.
- 다음으로, 튜브를 37ºC의 수조에서 15-60 분 동안 배양하고 완충액과 효소를 냉동실에 다시 넣으십시오.
- 다이제스트를 실행하기 위해 아가로스 젤을 준비하려면 250mL 플라스크에 아가로스 분말 1g과 TAE 완충액 100mL를 섞습니다.
- 용액이 끓지 않도록 주의하면서 최대 전력으로 약 90초 동안 용액을 전자레인지에 돌립니다.
- 그런 다음 장갑이나 열 패드를 사용하여 전자레인지에서 용액을 조심스럽게 제거하고 약 15분 동안 식힙니다.
- agarose 용액이 식는 동안 주조 트레이를 설정하십시오.
- 아가로 스 용액이 식으면 용액에 5 μL의 10,000X SYBR Safe gel stain을 첨가합니다.
- 젤 전기 영동 장치의 주조 트레이에 젤의 우물을 만드는 데 사용되는 빗을 추가하십시오.
- 아가로 스 젤 용액을 주조 트레이에 붓고 응고시킵니다.
- 젤이 단단해지면 빗을 똑바로 위로 당겨 젤에서 제거한 다음 적절한 경우 주조 트레이에서 댐을 제거합니다.
- 웰이 음극 또는 검은색 전극에 가장 가깝게 위치한 전기영동 챔버에 겔을 놓고 챔버를 1x TAE 버퍼로 채워 겔을 완전히 덮습니다.
- 수조에서 샘플을 제거하십시오.
- 그런 다음 각 샘플에 8.3 μL의 6X 로딩 염료를 추가합니다.
- 알려진 크기의 DNA 단편이 포함된 pBR322-BstN1 다이제스트 10μL를 첫 번째 웰에 분배합니다.
- 그런 다음 25μL의 샘플 StuI를 두 번째 웰에 로드합니다.
- 25μL의 샘플 BsRGI를 세 번째 웰에 넣습니다.
- 25μL의 샘플 S+B를 네 번째 웰에 로드합니다.
- 젤을 실행하려면 리드를 전기 영동 챔버에 꽂은 다음 전원 공급 장치에 연결하십시오. 빨간색 양극 리드는 우물에서 가장 멀리 떨어진 끝에 있어야 하고 검은색 음극 리드는 우물에 가장 가까워야 합니다. 이는 샘플이 음성에서 양수로 실행되기 때문입니다.
- 전원을 켜고 젤 박스를 약 60분 동안 170볼트에서 작동하도록 설정합니다.
- 실행이 완료되면 젤 상자의 전원을 끄고 탱크에서 전극을 분리하십시오.
- 그런 다음 전기 영동 챔버에서 젤을 제거하고 UV transilluminator로 관찰합니다. 주의 : 고글을 착용하거나 제공된 실드를 사용하여 자외선으로부터 눈을 보호하십시오.
- 마지막으로 휴대폰 카메라를 사용하여 젤 표면 바로 위에서 평행하게 젤 사진을 찍습니다.
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- 실험실에서 실행한 젤을 StuI를 사용하여 가상 효소 분해물과 비교하십시오.
- StuI를 사용한 가상 다이제스트는 7개의 밴드를 생성했습니다. 젤의 StuI 레인에 있는 밴드를 세고 이것이 가상 다이제스트와 일치하는지 또는 유사한 패턴을 보이는 것처럼 보이는지 확인합니다. 참고: 아가로스 전기영동 겔의 작은 띠는 종종 보이지 않습니다.
- 이제 BsrGI 다이제스트의 결과를 확인하십시오. BsrGI를 사용한 가상 다이제스트는 6개의 밴드로 구성되었습니다. BsrGI 레인에 있는 밴드의 수를 셉니다. 다시 말하지만, 가상 다이제스트와 랩 다이제스트가 동일하거나 유사한 패턴을 보였는지 여부를 확인합니다.
- 마지막으로 StuI와 BsrGI를 사용하여 가상 다이제스트를 살펴봅니다. 두 효소를 모두 사용한 가상 분해는 12개의 밴드를 생성했습니다. 겔의 해당 레인에 있는 밴드를 세고 DNA 밴딩 패턴이 가상 다이제스트와 유사한지 고려하십시오.
Q1: Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?
SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.
Q2: What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.
Q3: How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?
Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.
Q4: What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?
Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.
Q5: Why are different buffers required for different restriction enzymes?
Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.
Q6: How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?
DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.
Q7: What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?
Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.