컬럼 크로마토그래피

출처: Lara Al Hariri 및 Ahmed Basabrain, University of Massachusetts Amherst, MA, USA

1. 확장

   이 실험에서는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 녹색 식용 색소를 에리오글라우신(erioglaucine)과 타르트라진(tartrazine)이라고 하는 파란색 및 노란색 염료 성분으로 분리합니다. 먼저 95% 에탄올을 사용하여 실리카겔에 대한 친화력이 약한 염료를 용리합니다. 그런 다음 컬럼에서 두 번째 염료를 물로 씻어냅니다. 정제된 염료를 회수하려면 컬럼을 떠날 때 각 염료 띠를 수집합니다. 이렇게 수집된 부피를 분획(fraction)이라고 합니다.

   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-2">
   시작하려면 실험복, 보안경, 니트릴 장갑을 착용하십시오.
   • 기둥이나 뷰렛을 중앙 공급 구역으로 가져옵니다. 면이나 유리솜 조각을 구하여 기둥 상단에 누릅니다. 끝이 뭉툭한 긴 철사나 막대를 사용하여 아래로 눌러 마개 바로 위의 기둥을 막습니다. 메모: 면은 안정적이어야 하지만 용제가 쉽게 통과해야 하므로 너무 조밀하게 포장하지 마십시오. 마개가 플러그에 걸리지 않고 자유롭게 회전할 수 있는지 확인하십시오.
   • 뷰렛 클램프를 실험실 스탠드에 부착하고 그 아래에 약 4인치의 공간을 두고 기둥을 똑바로 고정합니다. 마개가 닫혀 있는지 확인하십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-5">
   100mL 비커에 'waste'라는 라벨을 붙이고 컬럼 아래에 놓습니다.
   • 다음으로 타르 중량 측정 보트에서 모래 1g을 측정하고 벤치로 다시 가져옵니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-7">
   그런 다음 면 플러그 상단에서 약 0.5cm 위에 열을 표시하십시오.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "1-8">
   기둥 상단에 작은 깔때기를 놓고 깔때기를 통해 충분한 모래를 부어 플러그 위로 0.5cm 깊이의 층이 있도록 합니다. 이렇게 하면 실리카겔이 플러그를 통해 분획으로 들어가는 것을 방지할 수 있습니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-9">
   깔때기를 제거하고 기둥을 부드럽게 두드려 모래를 고르게 분포시킵니다.
   • 이제 용리액을 준비합니다. 50mL 비커와 50mL 눈금이 매겨진 실린더에 '물'이라는 라벨을 붙입니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-11">
   눈금이 매겨진 실린더로 50mL의 탈이온수를 측정하여 비커에 붓습니다.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "1-12">
   그런 다음 다른 50mL 비커와 50mL 눈금이 매겨진 실린더를 '에탄올'로 표시합니다. 50% 에탄올 95mL를 계량하여 이 비커에 붓습니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-13">
   이제 4-5개의 깨끗한 파스퇴르 피펫과 피펫 전구를 얻으십시오. 컬럼의 내벽을 따라 7 – 8mL의 에탄올을 부드럽게 피펫팅합니다. 이 용매 층을 사용하면 모래를 방해하지 않고 이 실리카겔 슬러리를 컬럼에 부을 수 있습니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-14">
   마개를 열고 ~1mL의 에탄올을 폐기물 비커로 배출하여 마개에서 공기를 씻어내고 용매가 플러그를 통해 쉽게 흐르는지 확인합니다. 모래와 플러그에 마른 부분이 없는지 확인하고 기둥 측면을 부드럽게 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-15">
   다음으로, 컬럼 상단에 깨끗한 깔때기를 놓고 세 번째 50mL 비커에 '에탄올 실리카겔 슬러리'라고 라벨을 붙입니다.
   • 실리카겔 분말 5g의 무게를 조심스럽게 측정하고 라벨이 표시된 비커에 붓습니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-17">
   그런 다음 실리카겔, 유리 막대 및 에탄올 눈금이 매겨진 실린더를 에탄올 디스펜싱 후드로 가져옵니다.
   • 18mL의 95% 에탄올을 측정하여 비커에 붓습니다. 질감이 일관되고 마른 부분이나 가루 덩어리가 남지 않을 때까지 유리 막대로 혼합물을 저어줍니다. 일반적으로 ~1분이 소요됩니다. 참고: 슬러리는 반죽처럼 두꺼워야 하지만 여전히 쉽게 흘러야 합니다. 슬러리가 너무 뻣뻣하면 깔때기가 막히거나 컬럼에 기포가 갇힐 수 있습니다.
   • 분말이 에탄올에 완전히 현탁되면 벤치로 가져옵니다. 질감이 다시 일정해질 때까지 슬러리를 저어주고 즉시 컬럼에 붓습니다.
   • 실리카겔이 가라앉아 기포를 제거할 때 컬럼의 측면을 부드럽게 두드립니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-21">
   비커에 1 또는 2mL의 에탄올을 헹구고 헹굼을 컬럼에 붓습니다. 그런 다음 깔때기를 제거하고 따로 보관하십시오.
   • 컬럼 내부를 따라 에탄올을 피펫으로 분사하여 벽에 붙은 입자를 씻어냅니다. 그런 다음 반월판이 실리카겔 상단보다 약간 위에 올 때까지 용매를 배출합니다.
   • 이제 5 또는 10mL 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 약 0.8mL의 녹색 식품 염료 용액을 얻습니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-24">
   깨끗한 피펫을 사용하여 염료 용액 5-7방울을 실리카겔 상단에 고르게 부드럽게 바릅니다. 필요한 경우 에탄올 몇 방울을 추가하여 실리카겔을 덮습니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-25">
   염료가 스며들 때까지 기다리는 동안 두 개의 깨끗한 50mL 비커에 '에탄올 분획'과 '물 분획'으로 표시합니다. 컬럼 아래의 폐기물 비커를 에탄올 분획 비커로 교체하십시오.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-26">
   다음으로, 실리카겔을 방해하지 않도록 내벽을 따라 첫 번째 mL를 피펫으로 메
   틀링하여 컬럼을 채웁니다. < 데이터 하위 메모 항목 = "1-27">
   그런 다음 마개를 반쯤 열고 15 – 20초마다 용매 수준이 ~20mL 감소할 때까지 조정합니다.
   • 에탄올이 계속 흐르도록 열을 주기적으로 다시 채웁니다. 항상 실리카겔 위에 최소 1cm의 용매가 있는지 확인하십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-29">
   노란색과 파란색 띠가 분리될 때 모니터링합니다. 메모: 물러나야 하는 경우 자리를 비운 동안 기둥이 마르지 않도록 마개를 닫으십시오. 복합 띠가 넓어지기 시작하므로 한 번에 1분 이상 멈추지 마십시오. 일반적으로 더 빠르게 움직이는 염료가 컬럼을 떠나는 데 약 20 – 35분이 걸립니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-30">
   에탄올 분획 비커에 빠르게 움직이는 염료를 모두 모았으면 마개를 닫고 에탄올 분획을 따로 보관한 다음 폐기물 비커를 기둥 아래에 놓습니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-31">
   메니스커스가 실리카겔 상단 바로 위에 올 때까지 용매를 배출합니다. 그런 다음 폐 비커를 물 분획 비커로 교체하십시오.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-32">
   깨끗한 피펫을 사용하여 컬럼 상단을 탈이온수로 채웁니다. 그런 다음 15 – 20초마다 약 1mL의 속도로 컬럼을 통해 물이 흐를 수 있을 만큼만 마개를 엽니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-33">
   두 번째 색상 밴드가 열을 완전히 떠날 때까지 필요에 따라 열을 물로 다시 채웁니다. 일반적으로 15-25분 정도 더 걸립니다. 그런 다음 마개를 닫고 물 분획 비커를 폐기물 비커로 교환합니다.
   • 이제 컬럼을 완전히 배수하고 마개를 열어 두십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-35">
   실험 노트에 에탄올과 물 분획의 색상을 기록하십시오.
   표 1: 식품 염료의 컬럼 크로마토그래
   피
   	색	부피 (mL)
   에탄올 분획
   수분 분획
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   .
   • 분획을 해당 50mL 눈금 실린더에 붓고 각 분획의 부피를 기록합니다. 그런 다음 마개를 닫고 기둥을 흄 후드로 가져옵니다.
   • 실리카겔이 건조될 수 있도록 후드에 컬럼을 똑바로 고정합니다. 강사가 컬럼을 청소하는 방법을 알려주거나 실습 후에 칼럼을 관리할 것입니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-38">
   이제 수집된 분획과 남은 에탄올, 물, 염료 용액을 배수구로 씻어내고 나머지 유리 그릇은 평소와 같이 청소하십시오.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-39">
   사용한 파스퇴르 피펫을 유리 폐기물에 버리십시오. 사용한 종이 타월과 계량 보트를 실험실 쓰레기통에 버리고 떠나기 전에 벤치 탑을 청소하십시오.
2. 확장

   이 실험에서 에탄올이 파란색 에리오글라우진을 적시에 용리하는 것을 확인했지만 노란색 타르트라진에는 효과적인 용리액이 아니었습니다. 녹색 염료의 종이 크로마토그래피도 유사한 결과를 보여줍니다. 따라서, 우리는 에리오글라우진이 타르트라진보다 실리카겔에 대한 친화력이 낮다는 결론을 내렸습니다.

   이제 두 가지 용매를 사용하여 염료를 개별적으로 용리시키는 이점을 고려하십시오. 물은 에탄올보다 극성이 더 높기 때문에 에탄올 단독보다 두 염료를 더 빨리 용리할 것이라고 가정합니다. 물만 사용했다면 전체적으로 용매를 덜 사용했을 것이지만 분리가 더 나빠서 순수한 분획을 수집하기가 더 어려워졌을 것입니다.

   또는 에리오글라우신을 채취한 후에도 에탄올을 계속 사용할 수 있었지만 그런 식으로 타르트라진을 용리하는 데 오랜 시간이 걸리고 많은 에탄올이 필요했을 것입니다. erioglaucine을 용출한 후 용리액을 물로 전환하면 순도를 희생하지 않으면서 시간을 절약하고 용매 낭비를 최소화할 수 있습니다.