염료의 UV-Vis 분광법

출처: Lara Al Hariri 및 Ahmed Basabrain, University of Massachusetts Amherst, MA, USA

1. 확장

   실험실의 첫 번째 부분에서는 자외선 및 가시광선 흡수 분광법 또는 UV-Vis 흡수 분광법을 사용하여 플루오레세인, β카로틴 및 인디고 염료의 흡수 특성을 분석합니다. UV-Vis 분광법을 수행하려면 광원과 광검출기 사이에 용액을 배치합니다. 분자는 전자를 여기시키는 데 필요한 에너지에 해당하는 파장에서 빛을 흡수하고 나머지는 산란시키거나 전달합니다.

   흡수 스펙트럼은 검출기에 도달하는 각 파장의 광자 수의 변화를 나타냅니다. 더 높은 흡광도는 해당 파장에서 더 적은 수의 검출된 광자에 해당합니다. 먼저 순수 용매의 스펙트럼을 취하면 기기가 염료 용액의 스펙트럼에서 빼서 염료의 흡광도 데이터만 표시합니다. 이 참조를 solvent blank라고 합니다.

   • 시작하기 전에 실험복, 보안경, 장갑을 착용하십시오. 메모: β카로틴 및 인디고 솔루션은 각각 헥산과 디메틸포름아미드를 사용하므로 흄 후드에서 염료로 작업하게 됩니다. DMF와 헥산은 얇은 니트릴 장갑을 분해하므로 솔벤트가 묻으면 장갑을 교체하십시오.
   • 이제 깨끗한 석영 큐벳을 구하십시오. 큐벳은 일반적으로 두 개의 투명한 면과 두 개의 질감이 있거나 불투명한 면이 있습니다. 투명한 면을 깨끗하게 유지하기 위해 항상 큐벳의 질감이 있는 면을 잡으십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-5">
   먼저 물 속의 플루오레세인 용액을 분석합니다. 용매를 블랭크로 만들려면 큐벳에 탈이온수를 약 3/4 정도 채우십시오.
   • 이제 실험실용 물티슈로 큐벳의 투명한 면을 청소합니다. 큐벳에 기포가 있는지 확인하고 큐벳을 가볍게 두드려 기포를 제거합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-7">
   그런 다음 큐벳을 분광계로 가져옵니다. 분광계의 샘플 챔버를 열고 큐벳을 마지막으로 한 번 더 청소합니다. 얼룩과 먼지는 빛을 흡수하거나 반사할 수 있으며, 이로 인해 데이터에 오류가 발생할 수 있습니다.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "1-8">
   이제 투명한 면이 광원과 일치하도록 큐벳을 샘플 홀더에 삽입합니다. 시료 챔버 도어를 완전히 닫습니다. 분광계 소프트웨어의 지침에 따라 200 – 800 nm의 흡광도 스캔을 설정하고 큐벳을 솔벤트 블랭크로 스캔하십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-9">
   스캔이 완료되면 큐벳을 비우고 압축 공기를 사용하여 큰 물방울을 제거합니다.
   • 그런 다음 공유 후드로 가져오고 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 제공된 3μM 플루오레세인 용액을 큐벳 3/4로 채웁니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-11">
   큐벳을 분광계로 가져오기 전에 큐벳에 기포가 있는지 확인하고 필요에 따라 제거합니다. 샘플 챔버에 큐벳을 놓기 전에 투명한 면을 마지막으로 한 번 청소하는 것을 잊지 마십시오. 그런 다음 큐벳을 샘플로 스캔합니다.
   < 데이터 - 하위 메모 - 항목 = "1-12">
   스캔이 완료되면 플루오레세인이 흡수한 파장을 식별합니다. 흡광도가 가장 높은 파장을 λ_max라고 합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-13">
   흡광도 피크의 파장과 전체 흡수 범위를 실험실 노트북에 기록한 다음 데이터를 저장하십시오.
   표 1: 염료의 흡광도 및 λ_max
   	흡광도 범위(nm)	λ최대(nm)
   플루오레세인
   β카로틴
   남빛
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   . < 데이터 하위 노트 항목 = "1-14">
   이제 큐벳을 수성 폐기물에 비우고 물로 헹구어 플루오레세인의 흔적을 제거합니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "1-15">
   다음에 β카로틴을 분석할 것이므로 헥산 솔벤트 블랭크가 필요합니다. 큐벳에 헥산을 몇 번 헹구어 남은 물을 제거한 후 순수한 헥산을 3/4 정도 채웁니다.
   • 기포를 제거하고 큐벳의 측면을 청소한 다음 분광계에 넣습니다. 스캔이 200 – 800nm의 흡광도로 설정되어 있는지 확인한 다음 큐벳을 솔벤트 블랭크로 스캔합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-17">
   스캔이 완료되면 큐벳을 유기 폐기물에 비우고 압축 공기로 건조시킵니다.
   • 깨끗한 피펫을 사용하여 제공된 3μM β카로틴 용액을 큐벳 3/4에 채우고 분광계로 돌아갑니다.
   • 큐벳의 투명한 면을 청소하고 분광계에 넣은 다음 샘플로 스캔합니다. 피크의 파장을 실험실 노트에 기록하고 데이터를 저장하십시오.
   • 이제 인디고 염료를 분석합니다. 인디고 용액은 DMF에 있으므로 큐벳을 유기 폐기물에 비우고 남은 β카로틴과 헥산을 순수한 DMF로 헹굽니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "1-21">
   큐벳 3/4을 순수한 DMF로 채우고 분광계에 넣은 다음 스캔 설정이 이전과 동일한지 확인합니다. 솔벤트 블랭크 스캔을 실행한 다음 큐벳을 유기성 폐기물에 비우고 압축 공기로 건조시킵니다.
   • 깨끗한 피펫을 사용하여 제공된 3μM 인디고 염료 용액을 큐벳 3/4에 채우고 샘플로 스캔합니다. 흡광도 정보를 기록하고 데이터를 저장합니다.
   • 마지막으로 큐벳을 유기 폐기물에 비우고 아세톤으로 헹굽니다.
2. 확장

   실험실의 후반부에서는 UV-Vis 분광법을 사용하여 농도가 다른 5개의 β카로틴 용액의 흡광도를 측정하여 β카로틴의 흡광도 강도와 농도를 연관시킵니다. 이를 통해 흡광도 대 β카로틴 농도의 보정 곡선을 만들고 해당 관계를 설명하는 방정식을 도출할 수 있습니다.

   • 시작하려면 450nm에서 β카로틴 농도 및 흡광도에 대한 열이 있는 실험실 노트북에 테이블을 만드십시오.

     표 2: β-카로틴의 흡광도

     테스트	농도 (μM)	λmax(450nm)에서의 흡광도
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

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     .
   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-3">
   그런 다음 깨끗한 큐벳을 가져와 헥산을 3/4 가득 채우십시오.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-4">
   기포를 제거하고 큐벳의 투명한 면을 청소한 다음 분광계에 넣습니다. 200 – 800 nm에서 흡광도 스캔을 설정하고 큐벳을 솔벤트 블랭크로 스캔합니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-5">
   스캔이 완료되면 큐벳을 유기 폐기물에 비우고 압축 공기로 건조시킵니다.
   • 그런 다음 깨끗한 피펫을 사용하여 가장 낮은 농도 용액인 1.9μM β카로틴 용액을 큐벳 3/4로 채웁니다.
   < 데이터 하위 노트 항목 = "2-7">
   큐벳의 측면을 청소하고 분광계에 삽입한 다음 샘플로 스캔합니다.
   • 스캔이 완료되면 450nm에서 피크의 흡광도 강도를 표시합니다. 이를 1.9μM 용액의 흡광도로 실험실 노트에 기록하십시오.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "2-9">
   이제 큐벳을 유기성 폐기물에 비우고 헥산으로 헹구고 압축 공기로 건조시킵니다.
   • 깨끗한 피펫을 사용하여 큐벳에 3.7μM β카로틴 용액을 3/4 가득 채웁니다. 큐벳의 측면을 청소하고 분광계에 삽입한 다음 다른 샘플로 스캔합니다.
   • 스캔이 완료되면 450nm에서 피크의 흡광도를 기록합니다. 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 작업하여 나머지 용액에 대해 이 작업을 반복합니다. 완료되면 데이터를 저장하세요.
   • 마지막으로 큐벳을 유기 폐기물에 비우고 아세톤으로 청소합니다.
3. 확장

   먼저 세 가지 염료의 스펙트럼을 살펴봅니다. 물 속의 플루오레세인은 490nm에서 최대 흡광도로 파란색과 보라색 빛을 흡수합니다. 적색광을 흡수하지 않으며 약간의 노란색과 녹색광만 흡수합니다. 이와 일관되게 고체 플루오레세인은 빨간색이고 플루오레세인 용액은 일반적으로 노란색에서 녹색입니다.

   β카로틴은 파란색과 보라색 빛도 흡수합니다. 헥산에서 β카로틴의 최대 흡광도는 450nm이며 478nm에서 또 다른 큰 피크를 볼 수 있습니다. 보라색 빛의 강한 흡수는 β카로틴이 주황색으로 보이는 이유 중 하나입니다.

   DMF의 인디고는 자외선과 적색, 주황색 및 황색광을 흡수하며 611nm에서 뚜렷한 피크를 갖습니다. 따라서 인디고 염료는 주로 파란색과 자주색 빛을 반사하여 특징적인 색상을 부여합니다.

   < 데이터 하위 노트 항목 = "3-4">
   이제 β카로틴 농도에 대한 보정 곡선을 만듭니다. 실험실의 후반부에서 450nm에서 β카로틴 흡광도 값을 용액의 농도에 대해 플롯합니다.
   • 그런 다음 추세선을 적용하고 데이터에 맞는 선형 방정식을 찾습니다. Beer-Lambert 법칙에 따라 이 방정식에서 y는 흡광도, x는 농도, 기울기는 관련 몰 감쇠 계수와 경로 길이의 곱입니다.
   < 데이터 하위 메모 항목 = "3-6">
   방정식을 확인하십시오. 농도를 풀기 위해 재정렬하고 실험실의 첫 번째 부분에서 450nm에서 β카로틴 흡광도를 채웁니다. 계산된 농도는 3μM/L에 가까워야 합니다.