서던 블롯

서던 블로팅(Southern blotting)은 표지된 DNA 프로브가 표적 DNA와 혼성화되어 게놈 내의 특정 염기서열을 검출하는 기술입니다.

이 기술은 이 기술을 처음 개발한 영국의 생물학자인 에드윈 서던(Edwin Southern)의 이름을 따서 명명되었습니다.

이 절차는 전기영동, 변성, 멤브레인 전달, 혼성화 및 시각화의 5가지 주요 단계를 따릅니다.

먼저, 게놈 DNA는 제한 효소에 의해 분해되고, 생성된 DNA 단편은 아가로스 겔에 적재되고 겔 전기영동을 사용하여 분리됩니다.

이중 가닥 DNA를 두 개의 단일 가닥 DNA 또는 ssDNA로 변성 또는 분리하기 위해 겔을 수산화나트륨 용액에 담급니다.

그런 다음 겔을 염화나트륨과 트리스 완충액이 포함된 DNA 중화 용액의 스펀지에 올려 pH를 7.0으로 재설정합니다.

다음으로, 나일론 멤브레인을 젤 위에 놓고 종이 타월 더미로 무게를 잰다. ssDNA는 모세관 작용을 통해 막으로 전달되며, 중화 용액의 높은 염 농도는 DNA가 결합하는 데 도움이 됩니다.

자외선을 조사하면 DNA가 막에 공유 가교 결합됩니다. 이것은 확산을 방지하고 DNA 밴드를 고정시킵니다.

그런 다음 멤브레인을 변성된 연어 정자 DNA 용액에 담급니다. 이 용액은 멤브레인을 코팅하고 프로브 DNA와의 비특이적 결합을 방지합니다.

프로브는 표적 DNA 단편에 상보적인 염기서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA입니다. 시각화를 위해 프로브는 방사성 인(P-32) 또는 쉽게 검출할 수 있는 생성물을 생성하는 효소로 표지됩니다.

멤브레인을 프로브가 포함된 완충 용액에 담그고 42°C에서 가열하면 표적 ssDNA가 상보적 프로브 DNA와 쌍을 이루어 표지된 하이브리드 이중 가닥 DNA를 형성합니다.

하룻밤 혼성화 후, 멤브레인을 세척하여 결합되지 않은 프로브를 제거합니다.

방사성으로 표지된 DNA의 경우, 멤브레인은 검출을 위해 X선 필름에 노출됩니다.

효소 표지 프로브는 적절한 기질을 추가하고 색상 또는 발광이 진행됨에 따라 띠를 시각화하여 검출할 수 있습니다. 표지된 프로브는 관심 DNA 염기서열에만 결합하기 때문에 눈에 보이는 모든 띠는 표적 DNA의 존재를 나타냅니다.