4.5

서던 블롯

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서던 블로팅(Southern blotting)은 표지된 DNA 프로브가 표적 DNA와 혼성화되어 게놈 내의 특정 염기서열을 검출하는 기술입니다.

이 기술은 이 기술을 처음 개발한 영국의 생물학자인 에드윈 서던(Edwin Southern)의 이름을 따서 명명되었습니다.

이 절차는 전기영동, 변성, 멤브레인 전달, 혼성화 및 시각화의 5가지 주요 단계를 따릅니다.

먼저, 게놈 DNA는 제한 효소에 의해 분해되고, 생성된 DNA 단편은 아가로스 겔에 적재되고 겔 전기영동을 사용하여 분리됩니다.

이중 가닥 DNA를 두 개의 단일 가닥 DNA 또는 ssDNA로 변성 또는 분리하기 위해 겔을 수산화나트륨 용액에 담급니다.

그런 다음 겔을 염화나트륨과 트리스 완충액이 포함된 DNA 중화 용액의 스펀지에 올려 pH를 7.0으로 재설정합니다.

다음으로, 나일론 멤브레인을 젤 위에 놓고 종이 타월 더미로 무게를 잰다. ssDNA는 모세관 작용을 통해 막으로 전달되며, 중화 용액의 높은 염 농도는 DNA가 결합하는 데 도움이 됩니다.

자외선을 조사하면 DNA가 막에 공유 가교 결합됩니다. 이것은 확산을 방지하고 DNA 밴드를 고정시킵니다.

그런 다음 멤브레인을 변성된 연어 정자 DNA 용액에 담급니다. 이 용액은 멤브레인을 코팅하고 프로브 DNA와의 비특이적 결합을 방지합니다.

프로브는 표적 DNA 단편에 상보적인 염기서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA입니다. 시각화를 위해 프로브는 방사성 인(P-32) 또는 쉽게 검출할 수 있는 생성물을 생성하는 효소로 표지됩니다.

멤브레인을 프로브가 포함된 완충 용액에 담그고 42°C에서 가열하면 표적 ssDNA가 상보적 프로브 DNA와 쌍을 이루어 표지된 하이브리드 이중 가닥 DNA를 형성합니다.

하룻밤 혼성화 후, 멤브레인을 세척하여 결합되지 않은 프로브를 제거합니다.

방사성으로 표지된 DNA의 경우, 멤브레인은 검출을 위해 X선 필름에 노출됩니다.

효소 표지 프로브는 적절한 기질을 추가하고 색상 또는 발광이 진행됨에 따라 띠를 시각화하여 검출할 수 있습니다. 표지된 프로브는 관심 DNA 염기서열에만 결합하기 때문에 눈에 보이는 모든 띠는 표적 DNA의 존재를 나타냅니다.

Overview

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아가로스 젤 전기영동은 DNA 단편을 크기별로 분리하는 데 매우 유용합니다. 표본과 함께 알려진 길이의 단편이 포함된 DNA 사다리를 실행하면 표본 DNA 단편의 대략적인 길이를 결정하는 데 도움이 됩니다. 그러나 표본 DNA 단편의 서열 동일성을 확인하려면 추가 단계가 필요합니다.

변성된 DNA 단편은 프로브(타겟 DNA에 상보적이고 리포터 태그로 라벨링된 작은 ssDNA 단편)에 접근할 수 있도록 젤에서 캐리어 막으로 옮겨야 합니다. 이 과정을 서던 블롯팅(Southern blotting)이라고 합니다.

서던 블로팅 에서는 표적 DNA를 더 작은 조각으로 자르고 아가로스 젤겔에서 실행합니다. 단편을 변성시켜 단일 가닥을 만든 후 DNA를 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막으로 옮깁니다. 그런 다음 UV 조사(나일론의 경우) 또는 열 적용(니트로셀룰로오스의 경우)을 통해 단편이 막에 고정됩니다. 니트로셀룰로오스 막을 80°C의 오븐에서 굽는 것은 위험하기 때문에 나일론 막이 더 일반적으로 사용됩니다.

그런 다음 막을 표지된 프로브에 노출시킵니다. 프로브 DNA가 상보적인 서열을 찾으면 염기쌍을 형성하여 하이브리드 분자를 형성하고 결합되지 않은 과잉 프로브는 막에서 씻어냅니다. 그 다음에는 DNA 혼성화 패턴을 시각화하기 위해 자동방사선 촬영과 같은 검출 방법이 사용됩니다.

서던 블롯은 DNA를 식별하고 크기와 풍부도를 결정하는 데 유용합니다. 다양한 응용 분야에는 삭제, 삽입 또는 재배열과 같은 유전자의 변화 조사가 포함됩니다. 이는 또한 주어진 조직 표본에서 유전자의 복사본 수를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA는 젤에서 실행되기 전에 제한 엔도뉴클레아제에 의해 단편화되어야 하기 때문에 서던 블롯은 제한 부위가 변경된 경우 DNA 서열의 점 돌연변이도 감지할 수 있습니다.

복잡한 혼합물에서 RNA 서열을 식별하기 위해 노던 블롯팅(Northern blotting)이라는 유사한 기술이 사용됩니다. 이는 일반적으로 mRNA 전사물을 분석하여 특정 유전자의 발현을 검출하는 데 사용됩니다.

Transcript

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

서던 블로팅(Southern blotting)은 표지된 DNA 프로브가 표적 DNA와 혼성화되어 게놈 내의 특정 염기서열을 검출하는 기술입니다.

이 기술은 이 기술을 처음 개발한 영국의 생물학자인 에드윈 서던(Edwin Southern)의 이름을 따서 명명되었습니다.

이 절차는 전기영동, 변성, 멤브레인 전달, 혼성화 및 시각화의 5가지 주요 단계를 따릅니다.

먼저, 게놈 DNA는 제한 효소에 의해 분해되고, 생성된 DNA 단편은 아가로스 겔에 적재되고 겔 전기영동을 사용하여 분리됩니다.

이중 가닥 DNA를 두 개의 단일 가닥 DNA 또는 ssDNA로 변성 또는 분리하기 위해 겔을 수산화나트륨 용액에 담급니다.

그런 다음 겔을 염화나트륨과 트리스 완충액이 포함된 DNA 중화 용액의 스펀지에 올려 pH를 7.0으로 재설정합니다.

다음으로, 나일론 멤브레인을 젤 위에 놓고 종이 타월 더미로 무게를 잰다. ssDNA는 모세관 작용을 통해 막으로 전달되며, 중화 용액의 높은 염 농도는 DNA가 결합하는 데 도움이 됩니다.

자외선을 조사하면 DNA가 막에 공유 가교 결합됩니다. 이것은 확산을 방지하고 DNA 밴드를 고정시킵니다.

그런 다음 멤브레인을 변성된 연어 정자 DNA 용액에 담급니다. 이 용액은 멤브레인을 코팅하고 프로브 DNA와의 비특이적 결합을 방지합니다.

프로브는 표적 DNA 단편에 상보적인 염기서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA입니다. 시각화를 위해 프로브는 방사성 인(P-32) 또는 쉽게 검출할 수 있는 생성물을 생성하는 효소로 표지됩니다.

멤브레인을 프로브가 포함된 완충 용액에 담그고 42°C에서 가열하면 표적 ssDNA가 상보적 프로브 DNA와 쌍을 이루어 표지된 하이브리드 이중 가닥 DNA를 형성합니다.

하룻밤 혼성화 후, 멤브레인을 세척하여 결합되지 않은 프로브를 제거합니다.

방사성으로 표지된 DNA의 경우, 멤브레인은 검출을 위해 X선 필름에 노출됩니다.

효소 표지 프로브는 적절한 기질을 추가하고 색상 또는 발광이 진행됨에 따라 띠를 시각화하여 검출할 수 있습니다. 표지된 프로브는 관심 DNA 염기서열에만 결합하기 때문에 눈에 보이는 모든 띠는 표적 DNA의 존재를 나타냅니다.

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