16.12: 제자리 혼성화

제자리 혼성화(ISH)는 표지된 프로브를 사용하여 세포, 조직 또는 조직 절편에서 특정 DNA 또는 RNA 분자를 검출하고 위치를 파악하는 데 사용되는 기술입니다. 이 기술은 1969년에 핵산 연구를 위해 처음 사용되었습니다. 이는 현재 과학 연구 및 임상 환경, 특히 진단 목적에서 필수적인 도구입니다.

프로브 및 라벨 유형

프로브는 세포의 해당 뉴클레오티드 서열에 결합하는 DNA 또는 RNA의 상보적인 가닥입니다. 단일 가닥 DNA 프로브, 이중 가닥 DNA 프로브, 안티센스 RNA 프로브 또는 리보프로브, 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 프로브와 같은 다양한 프로브가 제자리 혼성화에 사용됩니다. 프로브의 선택은 민감도, 특이성, 안정성 및 조직 표본로의 침투 용이성을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.

이러한 프로브는 검출 목적을 위해 방사성 동위원소, 형광 염료 또는 기타 항원 분자로 표지될 수 있습니다. ^3H, ^35S, ^32P는 널리 사용되는 방사성 표지 프로브인 반면, 비방사성 표지에는 비오틴, 디곡시게닌, 플루오레세인이 포함됩니다. 이러한 라벨은 최종 라벨링, 닉 번역 또는 무작위 프라이머 합성 방법을 통해 프로브 DNA 분자에 부착될 수 있습니다. 자가방사선촬영, 형광현미경, 면역조직화학 등의 검출 방법은 혼성화된 프로브에 부착된 라벨을 기반으로 표적 시각화를 위해 사용됩니다.

제자리 혼성화의 장점과 단점

제자리 혼성화의 주요 장점 중 하나는 냉동 조직에도 적용할 수 있어 얻기 어려운 조직을 최대한 활용할 수 있다는 점입니다. 또한 면역조직화학과 같은 다른 기술과 결합하여 표본에서 단백질과 활성 mRNA를 검출할 수 있습니다. 그러나 DNA 및 RNA 복사본이 적은 표본을 사용하여 작업하는 동안 현장 혼성화를 사용하여 표적을 식별하는 것이 어려울 수 있습니다.

현장 혼성화(In situ hybridization)는 배양된 세포 또는 화학적으로 보존된 조직 절편에서 DNA 또는 RNA를 찾는 데 사용되는 기술입니다.

RNA in situ hybridization은 특정 mRNA 전사체를 검출하고 정량화하여 유전자가 발현되는 위치를 모니터링하는 데 사용됩니다.

타겟 mRNA는 DNA 템플릿의 체외 전사에 의해 생성되거나 화학 반응에 의해 합성되는 단일 가닥 상보적 RNA 프로브에 의해 검출됩니다.

프로브는 방사성 동위원소, 형광단 또는 비오틴 또는 디곡시제닌과 같은 기타 리포터 분자로 라벨링되며, 이는 라벨링된 항체에 의해 결합 및 검출될 수 있습니다.

RNA in situ hybridization에는 조직 고정, 투과화, 혼성화 및 검출의 네 가지 주요 단계가 있습니다.

우선, 조직 내의 생화학 반응을 중단하고 구조적 무결성을 보존하기 위해 신선한 조직을 수확하고 화학적으로 처리합니다. 이 보존 기술을 조직 고정이라고 합니다.

다음으로, 프로브가 표적 RNA에 접근하고 결합할 수 있도록 조직의 단백질과 지질을 제거해야 합니다.

단백질을 분해하고 세포막을 투과화하기 위해 샘플은 0.2 몰 염산과 단백질 분해 효소와 같은 효소로 처리되며 세제는 지질을 분해하는 데 사용됩니다.

그런 다음 표적 RNA는 RNA-프로브 하이브리드의 융점 바로 아래 온도에서 프로브와 혼성화됩니다. 이는 프로브가 상보적인 mRNA와 어닐링하는 데 도움이 됩니다. 언바운드 및 느슨하게 결합된 프로브는 여러 번의 세척을 수행하여 제거합니다.

혼성화된 프로브를 검출하는 방법은 라벨의 유형에 따라 다릅니다. 방사성 프로브는 사진 필름에 노출되는 반면, 형광 프로브는 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.

다른 라벨의 경우, 리포터 분자에 대한 항체는 형광 또는 비색 염료로 태그가 지정됩니다.

hybridized probe의 검출은 관심 유전자가 발현되는 위치를 나타내는 특정 mRNA의 분포를 보여줍니다.