16.15: 리보솜 프로파일링

리보솜 프로파일링 또는 리보 시퀀싱은 세포에서 활성 번역의 스냅샷을 생성하는 심층 시퀀싱 기술입니다. 리보솜에 의해 보호되는 mRNA의 서열을 선택적으로 배열하여 특정 시점에서 세포의 번역 환경에 대한 통찰력을 얻습니다.

리보솜 프로파일링의 응용

리보솜 프로파일링에는 특정 기관이나 조직 유형 내부의 번역에 대한 생체 내 모니터링과 새로운 단백질 합성 수준의 정량화 등 다양한 응용 분야가 있습니다.

이 기술은 번역된 개방형 판독 프레임을 식별하고 기능이 알려지지 않은 특성화된 단백질의 짧은 펩타이드 및 이소형을 포함하여 번역된 새로운 제품을 발견하는 데 도움이 됩니다. 리보솜 프로파일링은 또한 외부 신호를 받을 때까지 번역되지 않는 세포 내 여러 mRNA를 식별하는 데 도움이 됩니다.

리보솜 프로파일링의 기술적 프로파일링

리보솜 프로파일링은 대량의 표본에 대한 요구 사항, 시기적절한 번역 억제에 대한 의존성, RNA 오염과 같은 많은 기술적 과제에 직면해 있습니다.

급속 동결 기술은 신속한 번역 억제 문제를 극복할 수 있습니다. 이는 사이클로헥시미드와 같은 번역 신장 억제제에 비해 세포 내 리보솜 분포를 효율적으로 포착하는 데 도움이 됩니다.

mRNA에 결합하는 리보솜 RNA(rRNA)는 일반적으로 리보솜 프로파일링 중에 제거됩니다. 그러나 때로는 몇 가지 rRNA 오염 물질이 여전히 관찰됩니다. 연구자들은 dsDNA와 DNA-RNA 하이브리드를 절단하는 캄차카 게의 간췌장에서 분리된 rRNA 오염을 줄이기 위해 이중 특이적 뉴클레아제(DSN) 효소를 사용합니다. 이 방법은 차세대 시퀀싱 및 RNA-seq 라이브러리에서 rRNA가 고갈되기 전에 cDNA 라이브러리를 정규화하는 데에도 종종 사용됩니다.

리보솜 프로파일링의 또 다른 한계는 자료 분석에 있으며, 이를 위해서는 생물정보학에 대한 올바른 전문 지식이 필요합니다. R 패키지 RiboSeqR은 이 문제를 극복하는 데 사용되며, 이는 여러 표본에 대한 리보솜 프로파일링 자료를 해결하는 방법을 제공합니다.

전사되어 단백질로 번역되는 게놈의 영역을 식별하는 것은 게놈과 그 발현을 이해하는 데 중요한 단계입니다.

이는 리보솜 프로파일링(ribosome profiling)이라는 기법을 통해 이루어지며, 이를 리보-시퀀(ribo-seq)이라고도 합니다. mRNA에서 리보솜의 위치를 매핑하고 단백질로 활발하게 번역되는 mRNA를 식별합니다.

RNA를 분리하려면 먼저 세포를 용해시켜 세포 내부의 분자에 접근해야 합니다. 그런 다음 용해물을 RNase로 처리합니다. 이 효소는 리보솜으로 덮여 있지 않은 mRNA를 절단하여 보호된 mRNA 단편만 남깁니다.

그런 다음 리보솜으로 보호된 단편을 슈크로스 구배를 사용하여 보호되지 않은 절단된 단편에서 분리합니다.

그런 다음 mRNA 단편에서 리보솜을 제거하고 RNA를 RT-PCR에 의해 효소 역전사 효소를 사용하여 DNA로 변환합니다.

다음으로, DNA는 참조 게놈에서 염기서열을 분석하고 매핑합니다. 이것은 각 mRNA를 따라 리보솜의 정확한 위치를 결정합니다.

리보솜 프로파일링은 인식되지 않는 열린 판독 프레임(ORF)을 식별하는 데도 도움이 될 수 있습니다. ORF는 단백질로 번역될 수 있는 시작 코돈과 정지 코돈 사이의 DNA 영역입니다. ORF를 찾는 것은 새로운 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

포유류 세포주에서 유전자 발현 패턴에 대한 연구를 생각해 보십시오. 실험 절차에는 유전자 발현을 켜고 mRNA 합성을 시작할 수 있는 자극에 세포를 노출시키는 것이 포함됩니다.

활발하게 번역되고 있는 mRNA는 리보솜 프로파일링을 사용하여 식별됩니다.

이 실험은 유전자 B는 번역되고 있지만 유전자 A와 C는 번역되지 않는다는 것을 보여줍니다.

또한 약 100개의 뉴클레오티드 길이의 게놈의 작은 영역이 추가로 활발하게 번역되고 있음을 보여줍니다.

이 인식되지 않는 영역은 실험적 자극에 의해 상향 조절되는 새로운 단백질을 암호화할 수 있는 열린 판독 프레임입니다.