32.8: 컬럼 크로마토그래피의 원리

크로마토그래피 기술은 1901년 러시아 식물학자인 미하일 츠베트가 유기 용매를 사용하여 식물 색소를 분리하기 위해 처음 발명했습니다. 또한 1941년에 아처 마틴과 R. L. M. 신지는 실리카겔을 기둥에 채워 기술을 수정했습니다. 그런 다음 이동상으로 클로로포름과 물 혼합물을 사용하여 충전된 컬럼에서 아미노산 혼합물을 분리했습니다. 이는 컬럼 크로마토그래피에 관한 첫 번째 보고서였습니다. 현재 컬럼 크로마토그래피는 시료 혼합물에서 다양한 유형의 화합물을 분리하는 데 널리 사용되는 기술입니다.

효율적인 단백질 분리에 영향을 미치는 요인

컬럼 분자, 패킹과 같은 다양한 매개변수와 유속 및 온도와 같은 작동 조건이 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 효율성을 결정합니다.

컬럼 분자 또는 매트릭스의 선택에 따라 시료와의 상호작용 정도가 결정됩니다. 매트릭스 물질은 컬럼에 단단하고 균일하게 채워져야 합니다. 기포, 파편, 큰 입자 및 침전물은 컬럼을 통한 용매의 균일한 흐름을 방해하여 분리 효율성에 영향을 미칩니다. 또한 컬럼에는 미립자 물질이 없어야 합니다.

컬럼에 주입된 표본은 투명해야 하며 컬럼을 막아 용매 흐름을 방해할 수 있는 응집체가 없어야 합니다. 용매의 유속도 분리에 영향을 미칩니다. 용매의 유속이 매우 높거나 낮으면 화합물과 불순한 제제가 비효율적으로 분리됩니다. 매우 높은 속도는 컬럼 패킹을 방해하여 공정 효율성에 영향을 미칠 수도 있습니다. 또한 용출 버퍼의 구성도 중요한 요소입니다. 이는 현장 침전이나 용해를 방지하기 위해 부식성이 없고 시료 및 컬럼 분자와 호환되어야 합니다.

또 다른 작동 매개변수인 온도도 공정에서 중요한 역할을 합니다. 이는 시료, 컬럼 분자, 용매 완충액의 안정성을 결정합니다. 또한 컬럼 전체의 일정한 온도는 화합물을 효율적으로 분리합니다. 분리 과정을 완료한 후에는 추가 실행에서 표본 오염을 방지하기 위해 적절한 용매를 반복해서 통과시켜 컬럼을 철저히 세척해야 합니다. 때로는 막힌 물질을 제거하기 위해 용매가 반대 방향으로 컬럼을 통과하게 됩니다.

제한 사항

매우 널리 사용되는 기술이지만 이 방법에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 화합물의 분해능을 높이려면 유속을 느리게 해야 하므로 시간이 많이 소요되는 방법입니다. 또한 이동상에 필요한 다량의 고순도 용매로 인해 공정 비용이 많이 듭니다. 이는 또한 더 높은 수율의 순수 화합물이 필요할 때 확장 비용을 증가시킵니다.

컬럼 크로마토그래피는 물리적 및 화학적 특성에 따라 화합물을 분리하는 데 사용되는 생화학적 기술입니다.

그것은 두 가지 주요 구성 요소를 가지고 있습니다 - 고체 고정상 또는 매트릭스와 액체 이동상 또는 용매.

매트릭스로 채워진 컬럼에는 단백질 혼합물과 같은 샘플이 로드됩니다. 그런 다음 용매를 사용하여 컬럼을 통해 샘플을 운반합니다.

컬럼 내부에서 기질은 분자 그물망으로 작용하여 단백질의 크기 또는 기질과의 상호 작용에 따라 단백질을 필터링합니다. 큰 단백질은 작은 단백질보다 더 빨리 이동하는 경향이 있어 크기 기반 분리가 발생합니다.

또한 샘플의 단백질은 매트릭스와 상호 작용할 수 있습니다. 약한 상호 작용은 단백질이 빠르게 통과할 수 있도록 하는 반면, 강한 상호 작용은 컬럼 내에 단백질을 유지합니다.

용매의 pH 또는 이온 강도의 점진적인 변화는 단백질과 매트릭스의 상호 작용을 변경하고 단백질을 별도의 분획으로 용리하는 데 도움이 됩니다.