방법 논문

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

DOI:

10.3791/1133

⸱

2009년 3월 16일

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 절차에 신경근육학 교차로 (NMJ)에서 광 펄스로 신경 잠재력을 보여주고에 푸른 빛을 활성화 algal 채널 및 셀 - 특정 유전자 표현 도구를 사용하여 Drosophila 애벌레. 이 기술은 저렴하고 연구 및 교육 연구소에서 신경 생리학 연구를위한 흡입 전극 자극을 대체 사용하기 쉬운 것입니다.

프로토콜

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1 부 : 동물 관리 및 유전 십자가

  1. UAS - ChR2 및 표준 비행 미디어 8을 포함하는 별도의 병의 OK371 - GAL4 플라이 라인 유지합니다.
  2. OK371 - GAL4 플라이 라인과 UAS - ChR2 라인의 남성의 처녀를 수집합니다.
  3. 1 ㎜ 모든 트랜스 망막 (ATR)과 혼합 표준 플라이 미디어가 들어있는 유리병에 남성과 여성 모두를 넣어. ATR 음식은 ~ 1 분간 전자렌지에 처음으로 용해 정기 비행 미디어로하여야한다. 일단 녹아, 1 분 30 초 동안 냉각 후 비행 미디어의 매 10 ML 100 %의 ETOH에서 ATR 100 MM 100 μl를 추가할 수 있습니다. 얼음 플레이스 튜브, 그때 4 어두운 영역에 저장 ° C.를
  4. 파리의 친구를하자 22-25에서 어두운 지역에서 계란 ° C.를하다
  5. 셋째 instar의 유충을 볼 때까지 3~4일 기다려, 그 시점에서 파리 성충 처분.

2 부 : 릭 설정

  1. 블루 LED 어떤 10X 해부 범위 눈 조각 (우리의 경우, 칼 자이스 혈구 주식 회사, www.zeiss.com, 손우드, NY에서), 히트 싱크와 광원 (토르 연구소, www.thorlabs.com, 뉴턴, 뉴저지를 연결합니다 ). 게시하고 클램프와 자기 기지에 연결합니다. 광원에 의해 생성된 전기 노이즈를 줄이기 위해 전기 접지 방패로 히트 싱크를 커버.
  2. 전기 생리학 장비의 공기 테이블에서 광원과 장소 자석 기지.
  3. 회로를 제어 및 외부 전압 소스 (Powerlab 30분의 4, ADInstruments, www.adinstruments.com, 콜로라도 스프링스, CO)에 제어 회로를 연결하는 광원을 연결합니다.
  4. 푸른 불빛을 활성화하기 위해 회로를 제어하기 1-5 V의 펄스를 제공합니다.
  5. 마그네틱베이스와 광원 블루 라이트 빔은 애벌레 절개로 점유하는 영역에 초점을 맞춘까지를 조정합니다.

파트 3 : 해부

  1. sylgard - 줄지어 접시의 바닥에 6 ~ 0.1 mm 곤충 핀.
  2. 페트리 - 요리에 플라스틱으로 식품 미디어 및 장소에서 3 차 instar의 애벌레를 제거합니다.
  3. 음식을 제거하는 호수와 애벌레를 씻어.
  4. 플레이스 뽑아 핀 근처에 요리를 해부에 애벌레와 ½ 수준으로 살린 추가할 수 있습니다.
  5. 당신은 동물의 등의 표면을 따라 실행이 은빛 튜브 (기관)을 볼 수 있도록 동양 애벌레.
  6. tracheal 튜브 사이에있는 꼬리에 직접 큰 핀을 삽입합니다. 애벌레를 누른 상태의 머리에 두 번째 큰 핀을 장소, 길이 시체를 밖으로 스트레칭해야되고.
  7. 꼬리 근처에 작은 절개를 확인하고, 신체의 길이를 그것을 계속합니다. 우연히 복부 신경 및 / 또는 신체 벽의 근육을 건드리지 않게으로 가위의 끝을 그렇게 사육되었는지 확인합니다.
  8. 동물의 네 모퉁이에 플레이스 네 핀 이제 오픈 midsection의. 필릿 동물을 줄 수있는만큼 해부 접시에 그들을 설정합니다. 핀 준비 밖으로 가르쳤다.
  9. 포셉 및 가위를 사용하여 동물의 내장, 기관 및 지방 기관을 제거하십시오.
  10. 식염수에 준비를 씻어.
  11. 이마 엽 (叶) (같은 그림에서 본)와 준비의 복부 신경절을 찾습니다.
  12. 마이크로 가위를 사용하여, 신중하게 그냥 이마 엽 (叶) 뒤에있는 복부 신경절을 통해 했네요.

부 4 : 근육 녹음과 청색 광 자극

  1. 전자 전극 풀러 (셔터 인 스트 루먼트)를 사용하여 10-20 μω 전극을 당기세요.
  2. 3 M KCl로 뽑아 전극을 입력합니다.
  3. 이곳은 전기 생리학 장비에 대한 해부 현미경으로 애벌레 준비 근처 micromanipulator와 전극 홀더 및 기동 전극 팁의 전극을 가득 채웠다.
  4. 모든 신체 벽 세그먼트 (그림 A)의 근육 6 (M6)를 식별합니다.
  5. 조심스럽게 M6에 전극을 삽입하고 신속한 hyperpolarization 살펴보십시오. 근육 쉬고 막 잠재력은 -30에서 -70 뮤직 비디오 MV 곳이되어야합니다.
  6. 해부 준비가 광선에 중심 있도록 푸른 불빛을 조정합니다.
  7. 회로를 제어하는​​ MS 20-100 전압 펄스를 제공합니다. 점진적으로 회로를 제어하는​​ 공급 전압을 증가시킵니다. 근육 세포 (그림 1B)에 흥분성의 접합을위한 잠재력보세요.

대표 결과 :

그림 1A는 녹화 설정 및 토막 준비의 구조를 보여줍니다. 그림 1B 짧은 광 펄스에 의해 evoked 전형 EJP를 보여줍니다. 그림 EJP 진폭은 신경을 분포시키다 M6 모두 두명의 모터 뉴런의 진폭을 표현입니다. 낮은 조명의 농도 하나의 모터 유닛 (데이터가 표시되지 않음)만을 활성화.

figure-protocol-1

그림 1 : 세포 레코딩 장비 및 청색 LED와) 일반 설계도. 뇌 (브라질)은 복부 신경절 (VG)의 리듬 활동을 억제하기 위해 제거됩니다. ChR2은 GAL4 - UAS 시스템을 사용 모터 뉴런에 표시됩니다. M6 근육에서 B) 세포 녹음. 40 MS 블루 라이트 펄스 (127에서 μW / mm 2) 안정 M6 큰 잠재력 시냅스 (별표)를 보여주고 있습니다.

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토론

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중요 단계는 초기 절개와 근육 세포의 입력을 모두 포함하고 있습니다. 초기 절개하는 동안 신경이 절단되거나 근육이 손상된 경우 그것은 실험의 나머지 부분을 계속하기가 어렵습니다. 해부하는 동안, 하나 등 지느러미 절개하는 동안 이상 최대한 가위를 해부 각도 매우 신중해야합니다. 두 번째 중요한 단계 동안, 근육 세포를 입력할 하나는 과거 hyperpolarization ~ 30 뮤직 비디오에 대한 감시해야합니다. -30 MV 위의 값은 전극이 근육 세포 내에서 또는 건강하지 못한 세포에서 제대로도 아니라고 나타냅니다.

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공개 사항

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우리는 공개의 관심 충돌이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 LC 그리피스 건강 보조금 RO1GM - 33205와 MH - 067284 국립 연구소에 의해 그리고 NJ Hornstein에 브랜다 이스 대학 섬머 스쿨 학부 연구 장학 지원했다. 우즈 홀, MA에서이 기법에 대한 예비 실험은 2008 년 신경 시스템 및 행동 여름 코스 (R25 MH059472 NIMH 부여)의 일환으로 해양 생물학 연구소에서 수행되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
실가드엘스워스 접착제4019862www.ellsworth.com
Minutens 핀파인 사이언스 도구26002-10www.finescience.com
DissectingDish Fisher Scientificwww.fishersci.com
Neuroprobe 세포 내 증폭기 및 헤드 스테이지AM 시스템680100www.a-msystems.com
>Powerlab 4/30 데이터 수집 시스템<a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">figure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
Grass stimulatorGrass Technologies www.grasstechnologies.com
데스크탑 컴퓨터Dellwww.dell.com
DissectingScope Leica Microsystemswww.leica-microsystems.com
광원Dolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Fly Media
All-Trans-RetinalSigma-Aldrich116-31-4www.sigmaaldrich.com
>OK-371 Gal4 파리블루밍턴 스톡 센터
UAS-ChR2 FliesFiala lab, Griffith lab
LED 컨트롤러 회로내장 Griffith labhttp://www.ledsupply.com
http:// www.futureelectronics.com
구성:
1. 200mA 벅 퍽
2. 청색 LED
3. 절연 전선
4. 회로 빵 보드
LED 방열판Thorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
Air TableTMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
패러데이 케이지그리피스 연구소
내장 라이카 Leitz M 마이크로 매니퓰레이터Leica MicrosystemsACS01www.leica-microsystems.com
전극 홀더Axon Instrumentswww.axon.com
붕규산 유리FHC, Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
전극 풀러셔터 인스트루먼트 컴퍼www.sutter.com
HL 3.1 0.8mM Ca2+Contents (mM)를 함유한 식염수:
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8
MgCl2:4Sucrose:115
NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES
미세 해부 도구미세 과학 도구www.finescience.com
니.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

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Channelrhodopsin2Drosophila Neuromuscular JunctionSynaptic PotentialsGAL4 UAS SystemBlue Light StimulationElectrophysiology RigMuscle RecordingLarval DissectionExcitatory Junctional PotentialAll Trans Retinol

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