이 절차에 신경근육학 교차로 (NMJ)에서 광 펄스로 신경 잠재력을 보여주고에 푸른 빛을 활성화 algal 채널 및 셀 - 특정 유전자 표현 도구를 사용하여 Drosophila 애벌레. 이 기술은 저렴하고 연구 및 교육 연구소에서 신경 생리학 연구를위한 흡입 전극 자극을 대체 사용하기 쉬운 것입니다.
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방법 논문
에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 자극 Drosophila 신경근육학 분기점
이 논문에서
요약
프로토콜
1 부 : 동물 관리 및 유전 십자가
- UAS - ChR2 및 표준 비행 미디어 8을 포함하는 별도의 병의 OK371 - GAL4 플라이 라인 유지합니다.
- OK371 - GAL4 플라이 라인과 UAS - ChR2 라인의 남성의 처녀를 수집합니다.
- 1 ㎜ 모든 트랜스 망막 (ATR)과 혼합 표준 플라이 미디어가 들어있는 유리병에 남성과 여성 모두를 넣어. ATR 음식은 ~ 1 분간 전자렌지에 처음으로 용해 정기 비행 미디어로하여야한다. 일단 녹아, 1 분 30 초 동안 냉각 후 비행 미디어의 매 10 ML 100 %의 ETOH에서 ATR 100 MM 100 μl를 추가할 수 있습니다. 얼음 플레이스 튜브, 그때 4 어두운 영역에 저장 ° C.를
- 파리의 친구를하자 22-25에서 어두운 지역에서 계란 ° C.를하다
- 셋째 instar의 유충을 볼 때까지 3~4일 기다려, 그 시점에서 파리 성충 처분.
2 부 : 릭 설정
- 블루 LED 어떤 10X 해부 범위 눈 조각 (우리의 경우, 칼 자이스 혈구 주식 회사, www.zeiss.com, 손우드, NY에서), 히트 ....
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토론
중요 단계는 초기 절개와 근육 세포의 입력을 모두 포함하고 있습니다. 초기 절개하는 동안 신경이 절단되거나 근육이 손상된 경우 그것은 실험의 나머지 부분을 계속하기가 어렵습니다. 해부하는 동안, 하나 등 지느러미 절개하는 동안 이상 최대한 가위를 해부 각도 매우 신중해야합니다. 두 번째 중요한 단계 동안, 근육 세포를 입력할 하나는 과거 hyperpolarization ~ 30 뮤직 비디오에 대한 감시해야합니다. -30 MV 위의 값은 전극이 근육 세포 내에서 또는 건강하지 못한 세포에서 제대로도 아니라고 나타냅니다.
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공개 사항
우리는 공개의 관심 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 LC 그리피스 건강 보조금 RO1GM - 33205와 MH - 067284 국립 연구소에 의해 그리고 NJ Hornstein에 브랜다 이스 대학 섬머 스쿨 학부 연구 장학 지원했다. 우즈 홀, MA에서이 기법에 대한 예비 실험은 2008 년 신경 시스템 및 행동 여름 코스 (R25 MH059472 NIMH 부여)의 일환으로 해양 생물학 연구소에서 수행되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| 해부 접시 | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe 세포 내 증폭기 및 헤드 스테이지 | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 데이터 수집 시스템 |  ADInstruments | www.adinstruments.com | |
| Grass 자극기 | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| 데스크톱 컴퓨터 | Dell | www.dell.com | |
| 해부 현미경 | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| 광원 | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| 초파리 배지 | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 초파리 | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 초파리 | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED 제어 회로 | Griffith lab 자체 제작 | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com 구성 요소: 1. 200 mA Buck Puck 2. 청색 LED 3. 절연 전선 4. 회로 브레드보드 | |
| LED 방열판 | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| 에어 테이블 | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| 패러데이 케이지 | Griffith lab 자체 제작 | ||
| Leica Leitz M 마이크로 조작기 | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| 전극 홀더 | Axon Instruments | www.axon.com | |
| 붕규산 유리 | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| 전극 풀러 | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| 0.8mM Ca2+ 함유 HL 3.1 식염수 | 함량 (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES | ||
| 미세 해부 도구 | Fine Science Tools | www.finescience.com |
참고문헌
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Dros....
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재인쇄 및 허가
