우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.
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이 논문에서
요약
초록
우리의 프로젝트는 개발 애벌레의 날아 신경근육학의 버렸네에서 GFP 분류 glial 구조를 발견. 라이브 glial - 신경 근육 시냅스의 개발 봐, 우리가 사는 그대로 애벌레의 기능을 가진 애벌레 조직 준비를 개발뿐만 아니라, 좋은 광학 특성을했다. 이 새로운 준비도 버렸네에 perfusates의 액세스 허용. 우리는 파리 애벌레를 사용하여 인공 hemolymph에서 그들을 열중하고, 그들을 재미하여 정상적인 신체 리듬 수축을 완화. 다음 우리는 각 동물의 후부 세그먼트를 해부하고 뭉툭한 곤충 핀으로 뱃속을 통해 뒤로 입 부분을 밀고. 이것은 양말 안에 아웃을 바꾼 것처럼, 애벌레 신체 벽 everted. 우리는 울트라 미세 해부 가위로 절개를 완료하기 때문에 신체 벽 근육의 내장 측면을 노출. NMJ에 glial 구조는 glial 특정 발기인의 통제하에 멤브레인 대상으로 GFP를 표명했다. 근육의 포스트 시냅스 막, SSR (Subsynaptic Reticula)는 synaptically dsRed 대상으로 표시됩니다. 우리는 심하게 모터 신경 터미널 버렸네의 세 번째 부분을 라벨을해야했습니다. 이렇게하려면 우리는 멀리 붉은 발광 flurophore에 복합, HRP에 기본 항체 적용. 모터 신경 터미널과 SSR 사이 perisynaptic 공간으로 염료 확산 속성에 대한 테스트하기 위해, 우리는 멀리 붉은 발광 flurophore 및 회수 이미지를 복합 대형 Dextran 분자의 솔루션을 적용.
프로토콜
1 부 : 조직 준비
- 우리의 목표는 신경 시스템이 그대로 비행 유충의 조직 준비이지만, 본문 벽 근육의 내부 표면은 인공 hemolymph에 노출되며, 가까운 좋은 광학 현미경 커버 슬립에 위치하실 수 있습니다. 즉, 애벌레 준비 밖으로 안으로.
기존의 조직 준비는 절삭 달아 및 신체 벽 근육을 스트레칭하고, 때로는 신경계의 일부를 제거 참여 이후, 우리는 다른 접근이 필요했습니다.
우리가 구조 기능과 버렸네에서 시간이 지남에 따라 구조적인 변화를 잘 보라 얻을 싶어서 안으로 아웃 동물을 원했고, 우리는 신경계를 지키고 싶었어요. 우리는 또한 조직을 스트레칭 방지하려고하고, 근육 트위치 및 이미지를 망치 할거라 스트레치 수용체를 활성화. - 첫째, 동물을 무대. 셋째 애벌레 먹이 및 세 번째 애벌레 완더링 것은 우리가 W3 애벌레에서 보여주는 거고 그럼 해부하다에 크고 쉽습니다. 이 동물은 터비 표현형을 가지고 있으며, 다양한이므로 에버트하기 쉽습니다.
우리는 우리가 적극적으로 W3 애벌레를 포함하여 크롤 링 봤다 애벌레를 사용합니다. - 이중 소주 H2O의 배양 접시에있는 매우 부드러운 페인트 브러쉬와 구더기의 표면을 청소하십시오. 클린 애벌레 더 광학을 가....
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토론
이 절차는 라이브 표시된 단백질 및 세포 프로세스의 장기 이미징을 허용합니다. 우리가 설명에서 현장 조직 준비는 손상과 기능 CNS, PNS 및 반사 회로를했다. 이 조직 준비는 애벌레 몸 벽 근육이 늘어는 표준 애벌레 플라이 근육 프로토콜 (그것이 밖으로 고정된 경우) 이상의 장점이 있습니다. 스트레칭하면 시냅스 형태를 왜곡하고 반사 기반의 수축을 일으킬 수있다. 준비 밖으로 우리의 내부 기계 안정되었고, 실시간으로 세포 변화의 고해상도 분석을 용이 매우 좋은 광학했다. 또한 준비해서 내부는 시간 오랫동안 과정을 통해 시냅스의 변경 허용 시각화하기 위해 살아.
해부 동안, PNS 또는 CNS 손상을 방지하는데주의를 기울여야. 또한 근육 세포를 찢어하거나이 피해로 tracheae 당겨하지 마십시오. 가능한 한 편안한으로 신체 벽 근육 보관하십시오. HL - 6와 조직은 신체 벽 근육을 진정하고 횡단 바디 벽의 장력을 감소 칠링. 인공 hemolymph에의 칼슘.......
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감사의 글
이 프로젝트는 CIHR와 NSERC에 의해 후원되었다. 우리는 dsRed 표시된 SSR (BJ 선)와 UBC 바이오 이미징 시설을 표현 파리 변종의 생성에 기여를위한 바브 Jusiak을 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: 5 mM L-glutamate와 2 mM Calcium이 첨가된 인공 초파리 혈림프 | 시약 | N/A | NA | 5 mM L-glutamate는 근육 수축을 억제했습니다. Molecular grade L-Glutamate (Sigma)를 사용했습니다. 2 mM Calcium은 천연 유충 혈림프의 생리학적 Calcium 농도와 유사합니다. 참고 문헌: Macleod et al 2002 및 Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, 음이온성, 고정 가능 | 시약 | Molecular Probes, Life Technologies | D34680 | 염료의 총 부피를 낮게 유지하기 위해 소량 관류 챔버를 사용하십시오 |
| Anti-HRP-CY5 접합체 (염소) | 시약 | Jackson ImmunoResearch | 123-175-021 | 2.0 mg을 1 ml ddH2O에 희석한 후, 4 µL씩 소분하십시오. –20°C에서 냉동 보관하십시오. 소분된 한 개의 앨리콧을 100 µL의 HL-6에 희석하십시오 |
| Alexa 647 항체 표지 키트 | 시약 | Molecular Probes, Life Technologies | A10475 | 접합된 1차 항체를 총 80 µL 준비하여 2 µL씩 소분하여 보관했습니다. 표지를 위해 각 앨리콧을 100 µL의 HL-6에 희석했습니다. |
| Custom Formulated Objective Oil, 굴절률 1.3379 | 시약 | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| 초정밀 핀셋 | 도구 | Fine Science Tools | 11252-23 또는 11295-20 | |
| 스프링 가위 | 도구 | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| 초정밀 클리퍼 가위 | 도구 | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 관류 챔버 RC 20 시리즈 | 도구 | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc 공초점 현미경 | 현미경 | Quorum Technologies | Quorum Wave FX | Leica DMI6000 도립 현미경에 장착됨 |
참고문헌
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron te....
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재인쇄 및 허가
