접근 시냅스에 전기 생리학의 응용 프로그램 시냅스 돌연변이를 분석에 유용 시냅스 활동의 같지는 조치를 제공합니다. 이 문서 신경근육학 분기점 (NMJ)의 노출하는 데 사용되는 절개 방법을 설명합니다 Caenorhabditis 엘레간스 (C. 엘레간스) 그리고 잠시이 준비가 적용할 수있는 수있는 사용의 일부를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Neurotransmission는 뉴런이 빠른 시간 척도에 그들의 포스트 시냅스 목표로 화학 신호를 통해 정보를 전송하는 과정입니다. 이 복잡한 과정은 적절한 시냅스 연결, 전기 신호의 전도, 타겟팅 및 분비의 vesicles, 칼슘 감지, 소포의 융합, 현지화 및 postsynaptic 수용체의 기능 마중물을 보장하기 위해 많은 사전 및 사후 시냅스 단백질의 조정 활동이 필요하고 마지막으로, 재활용 메커니즘. neuroscientists로서 그것은 다음과 같이 각 기능을하는 단백질 명료하게하다와 행동 그들의 메커니즘을 이해하는 우리의 목표입니다. 시냅스에서 Electrophysiological 녹음 시냅스 전송 중에 발생하는 근본적인 전기 사건의 밖으로 읽기 같지는를 제공합니다. 분자와 유전 도구의 강력한 배열과 C로 시냅스 단백질을 조작 가능한이 기술을 결합하여 엘레간스, 우리는 시냅스 전달의 결과 기능 변화를 분석할 수 있습니다.
C. 엘레간스는 모터 신경 및 신체 벽 근육 제어 운동이 시냅스 1 따라서, uncoordinated locomotory phenotypes UNC (S라고도 함)와 돌연변이가 자주 교란 시냅스 전송 사이에 형성 NMJs. UNC의 돌연변이 세균 음식 소스의 풍부한 공급 유지되기 때문에, 그들은 음식을 알아보는 몇 가지 pharyngeal 펌핑 능력을 보유만큼 가능한 남아 있습니다. 이 같이 사실과 그 C. 엘레간스가 나온것과 같은 존재, 그들은 정교한 짝짓기 행동에 대한 필요없이 돌연변이 자손에 전달할 수 있습니다. 이러한 특성은 NMJs 2,3,7 정확히 어떻게 UNC 돌연변이의 영향 neurotransmission 주소로하는이 훌륭한 모델 유기체를 만드는 벌레에서 기록하기 위해 최근 기능과 결합.
절개 방법은 NMJs를 노출 웜 표피에 절개를하기 위해 cyanoacrylic 접착제를 사용하여 immobilizing 성인 웜을 포함됩니다. C. 이후 엘레간스 성인은 절개가 해부 현미경의 사용과 수행 및 뛰어난 판단력을 필요로합니다 길이에서만 1mm입니다. NMJ 레코딩은 전체 세포 개별 바디 벽 근육 세포 및 신경 전달 물질 자료를 클램핑 전압 전기 자극 광 - 활성화된 채널 rhodopsin - 중재 탈분극 4 될 모든 중 hyperosmotic 호수를 포함하여 자극 프로토콜의 다양한 사용 evoked 수에 의해 만들어진 간단히 설명했다.
프로토콜
해부에 사용되는 도구 A. 준비.
- 해부 / 녹음 챔버 : 우리가 일반적으로 22mm 직경 원형 덮개 유리를 수용할 수있을만큼 충분히 큰 것을 중심으로 몰락 원형 구멍, 1 / 16 일 인치 자석 시트 밖으로 우리의 기록 챔버를 구성. 챔버의 외부 크기는 레코딩을 할하는 데 사용되는 현미경 무대에 따라 달라집니다. 자성 시트의 뒷면에, 우리는 커버의 각 모서리에 낮게 녹아 Paraplax 조직 삽입 왁스의 펠렛을 배치하여 챔버를 준수 48 X 60mm 커버 슬립을 첨부 유리와 챔버 사이에 끼워 넣으면 슬립 . 그것이 지속적인 레이어 gluing 챔버에 커버 슬립을 형성 때까지 왁스 그런 다음, 유리 플레이트가 직면하고, 뜨거운 접시에 녹아있다. 왁스 빨리 녹으로이 단계는 무인 두지 마십시오. 챔버 제거하고 즉시 그 밀랍이 녹아서가로 냉각해야합니다. 22mm 원형 구멍의 안쪽 가장자리를 따라 새어가 초과 왁스는 면도날 에지를 사용하여 제거할 수 있습니다.
- Sylgard - 코팅 커버 풀렸는데 : 해부가 22mm, 녹화 챔버의 원형 캐비티 내에 배치됩니다 Sylgard - 코팅 커버 슬립에 수행됩니다. Sylgard 코팅은 cyanoacrylic 접착제가 다운 또한 웜은가 연결되면 접착제 피펫 팁을 다시 부수하는 쿠션 역할을 할 때 gluing 슬립 커버를 준수하는 데 도움이됩니다. Sylgard가에 따라 신선한 구성되어있는 지침을 (10 부품 실리콘 기지 1 무게로 에이전트를 치료 부분) 제조하고 있습니다. Sylgard의 작은 방울이 다음 각 표지 슬립에 위치하고 심지어 표면을 만들기 위해 면도날 에지를 사용하여 전체 발랐습니다. 코팅 커버 풀렸는데 대형 평면 적용 컨테이너에 배치하고 치료하기 위해 야간 65 ° 학위 오븐에 남아 있습니다.
- Pipettes : 일반적으로, 우리는 전극 풀러를 사용하여 근육의 표피 incisions과 녹음을하고, 아래 gluing의 벌레에 대한 pipettes를 생성하기 위해 동일한 1mm 외경 필라멘트 borosilicate 유리를 사용합니다. 이 단계는 pipettes 여러 신속한 교환을 요구할 수로 절개를하기 전에 pipettes의 항아리를 당길 것이 좋습니다입니다.
- 글루 작은 주걱 : 접착제가로드 입을 압력에 의해 접착제의 피펫의 끝에서 적용됩니다. gluing의 피펫은 피펫 유리 (보통 1mm)의 외경과 일치하는 내부 직경 폴리에틸렌 관의 2 피트 조각의 한쪽 끝을 삽입됩니다. 관의 다른 쪽 끝을는 마우스 피스와 같은 역할을 eppendorf 피펫 팁을 보유하고 있습니다.
- 추출 피펫 : 표피 절개가되었습니다되면 웜 내장이 웜 캐비티에서 제거되어야합니다. 이것은 접착제의 작은 주걱과 비슷한 eppendorf 피펫 팁에 연결된하지만이 경우에 유리 추출 피펫 팁이 계란과 내장 벌레를 구멍 밖으로 진공 청소기로 청소를 쉽게 할 수 있도록 충분히 다시 고장 튜브의 조각으로 이루어진다.
B. 해부
- 레코딩 챔버에서는 원형 왁스 펜 라인 Sylgard - 코팅 커버 슬립이 자리에 단단히 누를 수있는 챔버 (Sylgard - 코팅이 위쪽을 향하게)의 경계에 가까운 그린 것입니다. 이 왁스 라인 커버 슬립을 움직이게 이하 들어와서 및 해부 및 녹화 중에 커버 슬립을 dislodging에서 녹화 솔루션을 방지할 수 있습니다. 챔버는 다음 세포외 기록 솔루션으로 가득 여러 벌레는 벌레의 선택을 사용하여 중앙에 배치됩니다. 웜은 솔루션에서 수영을 것입니다 그러나 연습이 벌레는 그러한 움직임을 방지하기 위해 냉각으로 더 이상 절차없이 아래 붙은 수 있습니다. 훈련 단계 동안, 그것은 수영이 장애되는 gluing 돌연변이 웜 (예 : UNC - 31 돌연변이 등) 연습을하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 왁스 또는 모델링 점토에서 개최 PCR 모자의 유행 접착제 컨테이너는, cyanoacrylic 접착제의 작업 주식을 보유하는 데 사용됩니다. 기록 pipettes와 비슷한 팁 크기와 글루 pipettes은 (보통 ~ 4 megohms 저항) 접착제를 적용하는 데 사용됩니다. 접착제의 작은 주걱을 사용하여 접착제의 작은 금액은 접착제가 빨아으로 피펫 팁을 시각화하기 위해 절개 범위를 사용하여 접착제의 피펫으로 빨아.
- cyanoacrylic 접착제 (HistoacrylBlue, Aesulap)는 세포외 녹화 솔루션과의 접촉에 polymerizes, 따라서 그것 경화에서 접착제를 방지하고 피펫을 연결해하기 위해 챔버 솔루션을 입력으로 아교 피펫에 대한 긍정적인 압력을 유지하는 것이 중요합니다. 즉시 아교 피펫은 챔버 솔루션이므로, 접착제의 작지만 일정한 스트림 도전 막기 위해 입에 압력 제어 아래 Sylgard 표면에 적용해야합니다. 피펫가되면 그것이 때로는 부드럽게 sylgard - 코팅 유리에 팁을 감청에 의해 차단 수 연결. 그것은 당신이 아교 벌레하기 전에 gluing 연습을하는 것이 좋습니다. 당신이 정기적으로 벌레 너비보다 얇은 라인 만들어진 문자와 Sylgard에 접착제에 자신의 이름을 쓸 수있다면 당신은 PROC 준비gluing 웜 표피를 eed.
- 접착제 벌레를, 머리 또는 웜의 꼬리 하나에 접착제의 작은 금액을 연결하는 긍정적인 압력을 사용하여 빠르게 Sylgard 표면에 벌레를 그립니다. 벌레가 너무 가장자리 근처 녹음 pipettes로 도달하기 어려울 것입니다 접착으로 챔버의 중앙 근처에 웜을 첨부하여보십시오. 다음 (복부 근육 레코딩의 경우) 안쪽을 향하게 외음부와 C - 위치로 벌레를 강제, 시작 첨부 파일에서 웜의 표피의 지느러미 가장자리 접착제의 지속적인 흐름을 적용할 수 있습니다. 이 접착제 라인의 모든 간격은 웜이이 적극 표피 절개 단계 동안 분리에서 벌레를 방지하기 위해, 첨부 너무에 기입되어야합니다.
- 표피 절개하려면, 휴대용 절개의 피펫로 전환합니다. 이 피펫은 접착제 / 레코딩 pipettes보다 선명하고 짧은 튼튼한 샤프트를해야합니다. 해부 범위에서 가장 높은 배율을 사용하여 웜의 세로축에 피펫의 병렬 정렬과 표피 / 접착제 인터페이스에서 절개를하는 웜 (가까운 음문)를 따라 미드에 대한 제보를 삽입합니다. 이것은 절개는 절개 지점을 통해 계란과 창자를 강제 벌레의 수압을 출시. 당신이 인두에 도달할 때까지 편지를 열고 비슷한 깔끔히 모션으로 웜의 머리쪽으로 표피를 절단 계속합니다. 벌레의 내부 장기를 진공으로 추출 피펫으로 전환합니다. 절개를 비운 후, 열린 표피가의 원통형 모양을 유지합니다. Sylgard 표면에 표피의 상처 가장자리를 용접 현장에 신선한 gluing의 피펫을 사용합니다. NMJs를 손상 또는 왜곡되지 않도록이 단계에서 최소한의 접착제 장소를 사용하는 것이 중요합니다.
복부 신경 코드 및 바디 벽 근육 이제 노출됩니다. - , NMJs을 커버 지하 막을 제거 챔버에서 세포 녹화 솔루션을 빨아하고 10-20 초 정도 collagenase를 (세포 레코딩 솔루션 0.4mg/ml)을 적용하려면, 제거하고 신선한 세포 녹음 솔루션 여러 번 씻는다. 녹음 단계로 진행합니다.
C. 패치 - 클램프 녹음
- 센터 벌레를 위해 10X 목표를 사용하여 최대 오른쪽 현미경 무대에서 녹화 챔버를 놓습니다. DIC와 40X 물 출현 목표로 전환하고 본문 벽의 근육과 신경 코드가 손상되었는지 확인하십시오. 벌레의 세로축은 전극이 모두 왼쪽과 오른쪽 측면에서 도입 수 있도록, 범위의 전면 가장자리와 평행하게되도록 벌레를 놓습니다.
- 표준 패치 - 클램핑 기술을 사용하여 근육을 패치. 약 4 megohms 저항의 기록 전극은 잘 작동합니다. 전극은 근육 막에 접촉되면 gigohm의 밀봉을 얻을 때까지, 부정적인 압력을 증가. 전체 셀 전압 클램프 녹화 모드에 대한 자세한 흡입을 적용하고 gigohm의 인감이 터진 때까지 멤브레인 보내겠. 좋은 녹음에 야생 형 성인 벌레의 시체를 벽의 근육은 일반적으로 ~ 70 PF의 셀 멤브레인 용량을 가지고 있고 안정적으로 최소한의 유지 전류 (~ 50 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 적어도 10 분 동안 기록할 수 PA).
- NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 4, 포도당 10, 자당 5, HEPES 15 일 (산도 7.3 ~ 330mOsm) : 세포 녹화 솔루션 (MM)을 구성되어 있습니다. 패치 피펫은 (MM)를 포함 KCl 120 코 20, MgCl 2 4 (N - 트리스 [히드록시 메틸] mthyl - 2 - aminoethane - 술폰산) TES 5, 이수화물 CaCl 2 0.25, 나이 ATP 4 자당 36 , EGTA 5 (산도 7.2 ~ 312 mOsm). 참고 :이 솔루션은 인공적으로 GABA 수용체 - 매개 전류가 안쪽 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 염화물 유출로 인해되도록, 염화물과 함께 근육 세포를로드합니다. 이러한 솔루션에 대한 유사 (자세한 내용은 간행물을 참조) 사용되었습니다.
- 릴리스를 Evoked. 일반적으로 우리는 패치 근육으로 복부 신경 코드 앞쪽에에서 세포외 솔루션을 포함하는 두 번째 전극을 배치. 이 느슨한 패치 구성 야생 타입 웜에서 최대한의 evoked 응답 (일반적으로 2.0-2.5 NA)를 달성하기 위해 짧은 기간 동안 많은 depolarizing 자극 (볼트의 10 초의 순서에) (1 - 2ms)이 필요합니다. 이 방법의 한계는 다음과 같습니다 1) 신경 코드가 irreversibly 손상이되기 전에 단지 몇 evoked 반응이 알 수없는 이유로) 전달할 수 있습니다, 단 cholinergic evoked 반응이 자극의 구성을 사용 elicited 수 있습니다.
- 라이트 채널 rhodopsin의 자극을 활성화. 최근 고츠쵸크 연구소는 표현 조류 파생 표현 4 운전하는 데 사용되는 발기인에 따라 뉴런의 일부에 가벼운 자극시 막을 depolarize 채널 rhodopsins합니다.을 유전자 변형 벌레가 발생 C.의 경우 엘레간스 NMJ 역시 cholinergic 모터 뉴런 또는 GABAergic 모터 뉴런의 채널 rhodopsin을 표현하는 통합 노선 지금 availabl 아르E. 채널 rhodopsin은 모든 트랜스 망막이 옵신 잔기와 관련된 경우 조명에 대응 때문에,이 응용 프로그램에 사용되는 웜은 망막과 같이 엮여 박테리아에 성장해야합니다. 녹색 광 펄스는 다음 반복 유전자 변형 웜을 사용하는에 따라, ACH 또는 GABA 중 하나 evoked 출시를 일으키는 채널 rhodopsin을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 유전자 변형 벌레는 돌연변이 변종 넘어들어왔잖소 수 있습니다. 이전 전기 자극을 통해이 기법의 장점은 다음과 같습니다, 1) 라이트 - 활성화 GABAergic 또는 cholinergic 운동 뉴런이 독립적으로 공부를 할 수있는 하나의 자료를 Evoked) 많은 반복 stimulations 수행 2 수 있도록,의 연결을 손상을 발생하지 않습니다.
- Hyperosmotic 유발 놓습니다. 쉽게 - releasable 소포 수영장 (모든 NMJ의 기록 근육에에서 준비하는 vesicles의 표현 수영장을 반영)하는 데 사용됩니다 hyperosmotic 세포 솔루션 (추가 자당을 추가하여 ~ 850 mOsm 조정)이있는 압력 피펫의 크기를 측정합니다. 1-3초의 압력 - 펄스 응용 프로그램은 위에서 설명한 표준 솔루션을 사용하여 비동기 포스트 시냅스 이벤트 공세를 생성합니다.
그림 1 : C.의 도식 개요 엘레간스 해부 및 신경근육학 녹음 구성
유리와 치료에 걸쳐 Sylgard의 번짐 한 방울에 의해 sylgard 코팅 coverslip는 밤새 조립식 녹음 챔버의 원형 구멍에 위치하고 녹음 솔루션으로 덮여 있습니다. 중앙에 배치 웜은, 머리 또는 꼬리부터 웜 등의 측면에 접착제를 적용, 아교 피펫을 사용하여 Sylgard 표면에 붙어있다. 일단 gluing는 표피와 접착제 사이의 인터페이스에서 유리 바늘로 만든이고 머리 (레드 천공 라인 참조)쪽으로 확장, 외음부에 인접 절개 완료됩니다. 내장과 뱃속에서 알을 추출 다음, 절개의 상처 가장자리가 자리 - 용접 복부 신경 (녹색) 및 신체 벽 근육 (적색)을 노출 Sylgard에 접착제로. 외음부에 앞쪽에 복부 - 중간 근육 패치 - 고정되어과 자극 전극이 신경 코드에 상류 위치입니다.
대표 결과
전체 셀, 전압 - 고정되어 신체 벽 근육 레코딩은 (전기 evoked, 빛을 evoked 및 hyperosmotic 답변) 위에서 설명한 세 가지 자극 프로토콜 각각에 대해 표시됩니다. 모든 경우에 복부 - 중간 바디 벽 근육이 -60 뮤직 비디오에 고정되어 있습니다. A. 야생 형 근육 세포는 일반적으로 표준 레코딩 솔루션에 내생 안쪽 미니어처 시냅스 전류의 높은 속도를 나타냅니다. B.는 앞쪽에 복부 신경 코드의 2ms 탈분극 야생 타입 웜의 2-2.5 주변 NA의 큰 evoked 대한 응답으로 발생하는 여러 시냅스에서 동기 릴리스됩니다. A와 B의 야생 타입 흔적의 오른쪽에있는 대표적인 성분은 심각한 uncoordinated 돌연변이 (UNC - 18)에서 시냅스 릴리스를 보여줍니다. 패널 C는 cholinergic 뉴런의 채널 rhodopsin을 표현 야생 타입 웜 신경근육학 교차점에서 빛을 evoked 응답을 보여줍니다. 2ms 빛의 펄스는 일반적으로 1.5-1.8 NA의 응답을 생산하고 있습니다. D. 1S에 대한 근육에 850 mOsm hyperosmotic 호수의 압력 방출은 vesicles의 쉽게 - releasable 수영장을 나타내는 미니어처 시냅스 전류의 비동기 공세를 생성합니다.
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토론
유전자 모델 생물 C, 엘레간스은 이상적으로 시냅스 단백질을 인코딩 유전자에 돌연변이의 기능 분석을 통해, 시냅스 전달의 연구에 가장 적합합니다. 여기서 우리는 C를 렌더링 절개 기법을 설명했습니다 엘레간스는 electrophysiological 분석을위한 접근 NMJs. 함께 비디오 C.에서 중요한 단계를 모습 엘레간스 해부와 시냅스 활동을 측정하는 데 사용되는 일반적인 레코딩 구성. 이 방법을 학습의 가장 큰 도전을 제기 세 단계는 다음과 같습니다, 1) 웜 gluing 단계, 2) 성공적인 절개를 수행하고, 본문 벽의 근육에 3) 패치. 이들은 마스터되고 나면,이 준비 중 전압 또는 전류 클램프 - 클램프 모드에서 포스트 시냅스 근육의 기록 의무가 있습니다. evoked 자극에 응답은 쉽게 돌연변이 배경의 다양한이 해부하는 준비를 사용하여 측정할 수 있습니다. 야생 형 성인 웜 (길이 1 ㎜)의 이미 분 크기를 감안할 때, 성인기에 도달하거나...
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감사의 글
이 문서는 제리에 NIH의 부여에 의해 투자되었다. 나는 기록 데모 중 하나를 사용 cholinergic 모터 뉴런의 채널 rhodopsin을 표현 형질 벌레를 제공하는 닥터 알렉스 고츠쵸크 감사하고 싶습니다.
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참고문헌
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