방법 논문

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

DOI:

10.3791/1218

⸱

2009년 4월 6일

 , 
1Whitehead Institute for Biochemical Research, 2MIT - Massachusetts Institute of Technology

이 논문에서

요약

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신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

초록

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배아 두뇌 개발하는 동안 적절한 두뇌 뇌실 형성은 정상적인 뇌 기능이 필요합니다. 뇌 심실은 뇌척수로 가득하는 두뇌 내의 고도 보존 충치 있습니다. 그것이 두뇌 뇌실 형성의 결과로 액체로 채우고있는 동안 zebrafish에서 신경 튜브 형성 후, neuroepithelium는 constrictions과 주름 일련의를 겪습. 뇌실 형성 과정과 동시에 발생하는 neuroepithelial 모양의 변화를 이해하기 위해서, 우리는 뇌 조직에 비해 뇌실 공간을 시각화하는 방법이 필요했습니다. 그러나, 투명한 zebrafish의 배아의 본질은 어려운 뇌실 우주에서 조직을 차별화 수 있습니다. 따라서, 우리는 뇌실 공간이 형광 염료 가득한과 브라이트 및 형광 현미경으로 몇 군데있는 두뇌 뇌실 사출 기술을 개발했습니다. 브라이트과 형광 이미지는 다음 처리와 포토샵으로 겹쳐있다. 이 기법은 브라이트 이미지의 neuroepithelium의 형태 비교, 형광 염료와 뇌실 공간의 시각화를위한 수 있습니다. zebrafish의 뇌 뇌실 주입은 초기 애벌레 단계를 통해 18시간 게시물 수정에서 근무하실 수 있습니다. 우리는뿐만 아니라 두뇌 morphogenesis의 돌연변이 (1-3)를 특성화 같이 뇌실 뇌 형성과 morphogenesis 우리의 연구에 광범위하게이 기술을 사용했습니다.

프로토콜

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프로토콜

1 부 : microinjection에 대비하여

  1. 서터 인스 트루먼 트의 바늘 풀러를 사용하여 모세 바늘을 떼어하여 사출을위한 준비.
  2. 형광 염료 (예 : 텍사스 - 레드 Dextran 등)로 바늘을 입력합니다.
  3. micromanipulator과 microinjection 장치에 바늘을 탑재합니다.
  4. beveled 팁을 만들 수있는 각도로 적절한 크기로 바늘을 잘라요.
  5. 드롭 크기를 측정하고 기름 주입 당 1 2nl 사이에 있는지 확인합니다.

2 부 : 배아 준비

  1. 관심의 무대 30 분만 일찍 배아를 주사. 예를 들어, 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 심실을 공부하기 위해, 23.5 HPF에서 배아를 주입. 킴멀 외에 따라 배아를 무대. (4).
  2. stereomicroscope에서 신중하게 집게를 사용하여 태아의 chorion를 제거합니다.
  3. 1% 아가로 오스와 코팅 플라스틱 접시를 사용하여 플라스틱 1-200 μl 피펫 팁있는 아가로 오스의 구멍을 찌르지. 조심스럽게 집게를 사용하여 구멍의 아가로 오스의 플러그를 제거합니다.

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토론

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이 비디오에서 우리는 zebrafish 두뇌 ​​심실 개발에 형광 염료 (텍사스 - 레드 Dextran)를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 주변 neuroepithelium 달리 뇌 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용과 뇌실 공간의 형태뿐 아니라 주변의 뇌 조직의 모양을 결정하는 매우 유용합니다. 우리가 더 나은 살아있는 배아에서 시간이 지남에 따라 뇌 뇌실 형성 및 뇌 morphogenesis의 과정을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 뇌의 뇌실 형성 결함을 공부 및 초기 특성화 및 뇌 morphogenesis의 돌연변이 연구를위한 훌륭한 도구입니다.

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감사의 글

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저자는 실험실에서이 기술을 개발 로라 앤 로우 어리 감사하고 싶습니다. HS는 NIHMH70926에 의해 지원됩니다. 제니퍼 구츠맨은 CSBi / 머크 박사 친교에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
집게도구미세 과학 도구11252-20
모세관 (바늘)도구Frederick Haer and Co.30-30-1
아가로스 코팅 접시도구아가로스(Seakem GTG; Lonza) 요리 (Corning)아가로스 (50027) 요리 (430166)주입하는 배아의 단계에 따라 접시에 아가로스를 약 2-3mm 깊이로 만듭니다
해부 현미경Carl Zeiss, Inc.
형광 기능 및 이미지 캡처 소프트웨어 포함현미경 카메라 Tools
1-200 μ 피펫 팁ToolsUSA Scientific, Inc.1111-0806아가로스에 구멍을 뚫어 배아가 딱 맞도록 하는 완벽한 크기입니다.
Photoshop이미지 분석Adobe
Embryo Loop도구유리 피펫과 머리카락 또는 낚싯줄로 직접 만들고 밀랍으로 밀봉하십시오.
MicroinjectorToolsHarvard ApparatusPL1-100
니들 풀러도구Sutter Instrument Co.설정(히트 785, 풀 70, 벨로시티 40, 시간 70).
MicromanipulatorToolsNarishige International
형광 염료 Texas-Red Dextran 70,000MW시약분자 프로브, Life TechnologiesD1830원하는 경우 다른 분자량을 사용할 수 있습니다.
트리카인(3-아미노벤조산 에틸 에스테르)시약, 시그마-알드리치A-5040
배아 배지시약, 웨스터필드에 따르면 (5)
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
  2. Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafi....

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