브레인 은행 : 귀하의 연구 표본의 대부분을 만들기

요약

브레인 은행 및 생물 학적 물질의 체계적인 샘플링 불편 stereology의 기초를 제공하고 각 표본에서 얻은 잠재적인 데이터를 극대화할 수 있습니다.

초록

불편 stereology 정확하고 효율적으로 관심 주어진 영역에서 총 뉴런 번호 (또는 다른 세포 유형) 계산하는 방법입니다

프로토콜

1 부 : 조직의 사전 처리

1. 조직은 잘 paraformaldehyde, 글루 타 알데히드, 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 이것은 일반적으로 다른 장기를 수확하는 데 사용되는 표준 transcardial 재관류를 통해 달성될 수있다. 현재 연구에서 주제가 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)과 진정했고 완전히 exsanguinated 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused. 이것은 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 솔루션옵니다.
2. 두뇌는 stereotaxically, 차단 두개골에서 제거, 무게, 볼륨 ² 결정되어야합니다. 조직은 다음 인산염 버퍼의 30 % 자당의 최종 농도로 등급 자당 솔루션에 cryoprotected해야합니다. 조직 단위가 다음 -65 ° C에서 이소펜탄에 냉동과 -80에 보관해야 ° C가 슬라이스 준비가 될 때까지.

2 부 : 체계적인 샘플링

1. 체계적인 샘플링 이전 sectioning에 대한 적절한 계획에 의존합니다. 주동이의 - 꼬리와 지느러미 - 복부 extents 모두에 대한 관심의 전체 영역이 잘 정의되어야한다. 사용 종족의 stereotaxic 아틀라스는 관심의 영역을 정의하고 관심 영역의 길이를 결정하기 위해 도움이됩니다. 일단 관심 영역의 길이는 샘플링 간격을 설정하는 데 필요한 결정됩니다. 예를 들어, stereotaxic 아틀라스에서 당신은 코로나 비행기에 sectioning 때 관심 영역의 전체 rostro - 꼬리 정도 길이가 약 3mm 것을 확인하십시오. 그런 다음, 50μm에서 섹션에 그라 이오 스탯을 설정하려면이 속도에서 관심의 영역의 주동이의 - 꼬리 범위에 걸쳐 60 섹션을 결정합니다. 일반적인 편견 stereological 연구 60-10 체계적으로 샘플 섹션은 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 필요합니다. 이 예제에서 10 섹션은 동일 육분의 일 섹션의 샘플링 간격의 rostro - 꼬리 어느 정도 결과를 통해 간격.

파트 3 : 두뇌 은행의 창조

1. 섹션 샘플링 주파수가 결정되면, 다음 단계는 얼룩이 즉시 수행할지 결정하는 것입니다. 예를 들어, cresyl 제비꽃과 얼룩있다면 당신은 슬라이드에서 육분의 일 섹션을 사로잡을 것입니다. 이 시리즈 1 것입니다. 당신이 원하는 것을 아마도 몇 가지 잠재적인 항체가 알고있다면 실행 그렇다고 기본 얼룩을 제공하거나 immunohistochemistry을 수행할 수있는 시간이 없어도, 순서 섹션의 나머지 5 시리즈를 배치하는 데이터를 보려는 그들이 웰스가 포함된 항원 보존 (1 % 폴리비닐 pyrrolidone, o.1M PBS에서 50 %의 에틸렌 글리콜, 수소 이온 농도 7.4)를 자르고 있었다. 아래 표는 1 슬라이드와 두뇌 은행 (표 1)의 일부로서 섹션 1 접시 (표준 48 잘 판)의 구성 샘플링 방식을 제공합니다.
   
   표 1. 여기서 섹션 샘플링 주파수 1 / 6입니다. 첫 번째 섹션은 cresyl 보라색 얼룩을 위해 슬라이드에 배치하고 향후 5 섹션은 보존 항원에 게재됩니다. 제 번호는 7 다음 슬라이드에서 캡처되고 섹션은 9-12 보존 항원에 배치됩니다. 관심이나 조직의 블록의 영역이 철저하게 sectioned 때까지이주기가 반복됩니다.
2. 다음 단계는 철저하게 섹션 조직의 블록을하는 것입니다. 척에 미디어를 삽입의 작은 금액을 놓고 그것이 동결하자. 마이크로톰 머리에 척을 놓고 평평한 표면을 가지고 냉동 매체의 정도 떨어져 면도. 마이크로톰 머리와 그라 이오 스탯 내에서 플랫 플레이스에서 척을 제거합니다. 척에 미디어를 삽입 붓고 단단히 척에 단호하게 위치 stereotaxically 컷 측면과 뇌 블록을 놓으십시오. 천천히 그리고 완전히는 매체를 장착의 머리를 포함. 마이크로톰 머리와 섹션 샘플링 주파수에 대해 미리 정해진 매개 변수를 사용하여 섹션으로 두뇌와 척를 놓습니다.
3. 조직의 블록이 철저하게 sectioned되었으며 섹션이 우물에 배치되면, 뚜껑과 접시를 커버 parafilm으로 뚜껑을 버리고, -20 ° C의 냉장고에서 개최. 각 시리즈, 섹션 - 샘플링 간격, 각 동물에 대한 일련의 번호를 촬영 섹션의 총 수를에 로그인합니다. 이 로그는 미래 immunohistochemistry를위한 두뇌 은행에서 섹션의 후속 제거를 추적할 중요한 것입니다.

4 부 : 대표 결과 :

이러한 방식으로 조직적인 샘플링은 지난 3 년간 우리 연구실에서 표준 연습을하고 있습니다. 그것이 신호의 열화 (그림 1)하지 않고 자른 후에 우리가 알게 된 지 3 년 보존 항원에 저장되었습니다 물질에 대한 성공적인 수행 immunohistochemistry의 좋은 거래를했다합니다. 또한, 우리의 두뇌 은행의 일환으로 우리가 아닌 인간의 가까이에 20,000 체계 섹션 로그인영장류의 두뇌 (그림 2) 장기 연구 계획의 일환으로.

1.이 아닌 인간 영장류의 후두 극의 섹션입니다 그림 레이어 VI와 중간 흰색 물질 뉴런을 모두 보여주는 NeuN위한 immunostained. 이 특정 섹션 2 년간의 기간 동안 -20 ° C에 보존 항원에 저장되었습니다. 스케일 바 = 100μm.


그림 2. 우리 vervet 두뇌 은행은 현재 30여 원숭이에서 가까운 20,000 체계적인 섹션으로 구성되어 있습니다.

토론

체계적인 샘플링 연구 자료를 극대화하기위한 저렴한 방법입니다. 이 샘플링 전략 지역에 걸쳐 체계적인 샘플링을 필요로 불편 stereology의 규칙을 준수하도록 설계되었습니다. 그것은 각 시리즈에 대한 섹션의 순서를 유지하는 것은 매우 중요합니다. 저희 연구실에서는 성공적으로 햄스터와 비 인간 영장류 두뇌 섹션을 모두 은행에 대해이 방법을 사용했습니다. 지금까지 우리는 가까이에 20,000 vervet 원숭이 (Chlorocebus aethiops sabeus) 뇌 부분을 수집하고 정기적으로 년 이상 저장되었습니다 섹션에 immunohistochemisty을 수행합니다. 잘 특징 뇌 은행의 장점은 자금 조달 의사 결정, 신속하게 데이터를 수집하는 새로운 학생을위한 능력, 그리고함으로써 연구 기금을 극대화 새로운 동물의 사용 및 치료를 최소화간에 데이터를 수집하는 가능성을 포함합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에틸렌 글리콜	Fisher Scientific	E178-4
폴리비닐피롤리돈	Fisher Scientific	BP431-500
Thermal Scientific 임베딩 매질	Fisher Scientific