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방법 논문

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

34.9K 조회수

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DOI:

10.3791/1266

⸱

2009년 7월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec,GmbH

이 논문에서

요약

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

초록

조직에서 단일 셀 suspensions의 준비 세포 연구에 많은 실험을위한 중요한 사전 요구 사항에 해당됩니다. 전체 장기 dissociating의 과정은 재현성 방식으로 가능한 세포의 높은 숫자를 얻기 위해서는 특정 매개 변수를 필요로합니다. gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 악기는 마우스를 포함하여 폐 조직 유형의 다양한 효율적이지만 부드러운 분리에 최적화된 미리 프로그램된 설정이 포함되어 있습니다. 이 간행물의 생쥐에서 파생된 폐 조직에 gentleMACS의 Dissociator의 사용을 시연합니다.

프로토콜

무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.

1. 자료

  1. HEPES 버퍼 : 10 MM HEPES - NaOH 산도 7.4, 150 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl 2, 1.8 MM CaCl 2)
  2. Collagenase D 솔루션 : Collagenase D : 100 MG / ML (Collagenase D> 0.15 U / MG) HEPES에서 버퍼
  3. DNase I 솔루션 : 20,000 U / ML DNase I
  4. 산도 7.2에서 PBS 버퍼
  5. PEB 버퍼 : 20 부품 1 부품 BSA 주식 솔루션 Rinsing 솔루션 autoMACS
  6. 조직 : 인접한 장기 무료 7분의 6 week 오래된 성인 여성 BALB / C 마우스에서 파생된 폐.
  7. 옵션 : CD11c MicroBeads, 맥 MS 열, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포의 격리 Mac 용 세퍼레이터

2. 폐 조직을 Dissociating

  1. 적혈구를 제거하는 PBS가 포함된 배양 접시에있는 조직을 씻어.
  2. 4.9 ML의 HEPES 버퍼를 포함하는 gentleMACS C 튜브 450 MG의 폐 조직의 최대 전송합니다.
  3. 2 MG / ML Collagenase D.의 최종 농도 100 μL Collagenase D 솔루션 추가
  4. 150 MG 조직 (40 U / ML DNase I의 최종 농도) 또는 150-450 MG의 폐 조직을 20 μL DNase I (80 U / ML DNase I의 최종 농도)에 10 μL DNase I 솔루션을 추가합니다.
  5. 단단히 C 튜브를 닫고 gentleMACS의 Dissociator에 그것을 연결합니다. 그런 다음 프로그램 "m_lung_01"를 실행합니다.
  6. 37 30 분 품어 ° C 자동 또는 수동으로 회전마다 5 분 터닝과 함께.
  7. gentleMACS의 Dissociator에 샘플을 반환하고 프로그램 "m_lung_02"를 실행합니다.

3. 여과법

  1. 70 μm의 메쉬 셀 스트레이너와 뚜껑을 교체하여 필터링 세포를 수집하기 위해 50 ML 튜브를 준비합니다.
  2. 일단 두 번째 gentleMACS 프로그램이 튜브의 샘플 자료의 배포에 따라 종료, 당신은 튜브 하단의 샘플 자료를 수집하기 위해 간단히 튜브를 원심 수 있습니다.
  3. 적당한 1,000 μl 피펫 팁을 사용하여 C 튜브의 심장 봉인 캡을 통해 세포를 제거하고 세포 스트레이너에게 적용됩니다.
  4. RT에서 5 ML HEPES 버퍼와 셀 스트레이너 씻으십시오.
  5. 10 분 300xg에서 50 ML 튜브의 펠렛에 세포를 원심 분리기.
  6. 뜨는을 기음과 PEB 버퍼의 원하는 볼륨의 세포 펠렛을 resuspend.

4 부 : 대표 결과 :

figure-protocol-1
그림 1. gentleMACS ™ Dissociator과 폐 분리가 92% 가능한 세포의 결과. 죽은 세포는 찬란 propidium 요오드화물의 (PI) (; 없음 PI의 얼룩 왼쪽 도트 플롯 바로 도트 플롯)와 스테인드되었습니다.

figure-protocol-2
그림 2. 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율의 gentleMACS의 Dissociator 결과를 사용하여 마우스 폐 조직의 해리. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 유동세포계측법에 의해 분석되었다.

figure-protocol-3
그림 3. 마우스 폐 조직에서 파생된 단일 셀 정지 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 마우스 CD11c 낮은 M - PDCA - 1 + plasmacytoid의 DC가뿐만 아니라 CD11c 높은 세포를 감지하는 물들일했다.


figure-protocol-4
그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS 구분 기호와 두 MS 열을 사용하여 돌기 세포의 농축.

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토론

이 비디오에서는, 우리는 마우스 폐 조직의 분리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 저희는 폐 조직의 기계적 효소 치료의 조합이 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율을 알아낼 것을 보여줍니다. 특히, 조직의 기계적 붕괴는 gentleMACS의 Dissociator에 의해 달성되었다. 고정자 시스템, 부드러운 방식으로 dissociates 조직 - gentleMACS C 튜브는 로터가 포함되어 있습니다. 절차는 악기의 프로그램 설정에 의해 제어됩니다. 설정은 세포의 높은 수율과 생존을 달성하기 위해 최적화되었다. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 leukocytes과 내피 세포를 감지하는 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 단일 세포 현탁액에서 돌기 세포는 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 물들일되었습니다. 또한, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포는 맥 기술을 사용하여 풍부하게되었습니다. 돌기 세포는 자기 ...

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공개 사항

저자들은 본 논문에 사용된 장비를 제조하는 Miltenyi Biotec GmbH의 직원입니다.

감사의 글

Miltenyi Biotec 저자 GmbH를, 독일의 직원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C 튜브Miltenyi Biotec주문 번호 130-093-237http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ 스타터 키트Miltenyi Biotec주문 번호 130-093-235http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ 튜브 회전기Miltenyi Biotec주문 번호 130-090-753http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ 세척 용액Miltenyi Biotec주문 번호 130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA 스톡 용액Miltenyi Biotec주문 번호 130-091-376http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec주문 번호 130-052-001http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PEMiltenyi Biotec주문 번호 130-092-026130-091-830http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APCMiltenyi Biotec주문 번호 130-091-963http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITCMiltenyi Biotec주문 번호 130-092-026http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PEMiltenyi Biotec주문 번호 130-091-610http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
프로피듐 요오드화물 용액Miltenyi Biotec주문 번호 130-093-233http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach 피펫 팁Molecular BioProducts주문 번호 2079http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<무균 조건에서 작업하기 위해 모든 단계는 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 수행하는 것을 권장합니다. 1. 재료 HEPES 완충액: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2 Collagenase D 용액: HEPES 완충액에 희석한 Collagenase D 100 mg/mL (Collagenase D > 0.15 U/mg) DNase I 용액: 20,000 U/mL DNase I pH 7.2의 PBS 완충액 PEB 완충액: autoMACS Rinsing Solution 20부분에 BSA Stock Solution 1부분 혼합액 조직: 인접 장기가 제거된 6/7주령 성체 암컷 BALB/C 마우스 유래 폐 선택 사항: 마우스 폐 단일 세포 현탁액으로부터 수지상 세포를 분리하기 위한 CD11c MicroBeads, MACS MS Columns, MACS Separator 2. 폐 조직 해리 적혈구를 제거하기 위해 PBS가 담긴 페트리 접시에서 조직을 세척합니다. 최대 450 mg의 폐 조직을 4.9 mL의 HEPES 완충액이 담긴 gentleMACS C Tube로 옮깁니다. Collagenase D의 최종 농도가 2 mg/mL가 되도록 Collagenase D 용액 100 μL를 추가합니다. 조직이 150 mg 이하인 경우 DNase I 용액 10 μL(DNase I 최종 농도 40 U/mL)를 추가하고, 폐 조직이 150-450 mg인 경우 20 μL의 DNase I 용액(DNase I 최종 농도 80 U/mL)을 추가합니다. C Tube를 단단히 닫고 gentleMACS Dissociator에 장착합니다. 그 후 "m_lung_01" 프로그램을 실행합니다. 자동 회전 장치를 이용하거나 5분마다 수동으로 회전시키며 37°C에서 30분간 배양합니다. 샘플을 다시 gentleMACS Dissociator에 넣고 "m_lung_02" 프로그램을 실행합니다. 3. 여과 캡을 70 μm 메쉬 셀 스트레이너(cell strainer)로 교체하여 여과된 세포를 수집할 50 mL 튜브를 준비합니다. 두 번째 gentleMACS 프로그램이 종료되면, 튜브 내 샘플 물질의 분포 상태에 따라 튜브를 짧게 원심 분리하여 샘플 물질을 튜브 바닥으로 모을 수 있습니다. 적절한 1000 μl 피펫 팁을 사용하여 C Tube의 격막 밀봉 캡(septum sealed cap)을 통해 세포를 제거하고 이를 셀 스트레이너에 도포합니다. 실온(RT)에서 5 mL의 HEPES 완충액으로 셀 스트레이너를 세척합니다. 50 mL 튜브에서 300xg로 10분간 원심 분리하여 세포를 펠렛(pellet) 형태로 모읍니다. 상층액을 흡입 제거하고 원하는 부피의 PEB 완충액으로 세포 펠렛을 재현탁합니다. 파트 4: 대표 결과 그림 1. gentleMACS™ Dissociator를 이용한 폐 해리 결과, 세포 생존율이 92%로 나타났습니다. 사멸 세포는 propidium iodide (PI)로 형광 염색되었습니다(오른쪽 도트 플롯; 왼쪽 도트 플롯: PI 미염색). 그림 2. gentleMACS Dissociator를 이용한 마우스 폐 조직 해리를 통해 높은 비율의 생존 백혈구 및 내피 세포를 얻었습니다. 유도된 단일 세포 현탁액을 CD45-PE 및 CD146-FITC 또는 CD31-FITC로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였습니다. 그림 3. 마우스 폐 조직 유래 단일 세포 현탁액을 CD11c-FITC 및 Anti-mPDCA-1-APC로 염색하여 마우스 CD11clow m-PDCA-1+ 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid DCs)와 CD11chigh 세포를 검출하였습니다. 그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS Separator 및 두 개의 MS Column을 이용한 수지상 세포 농축 결과입니다.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

참고문헌

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).

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