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무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
1. 자료
- HEPES 버퍼 : 10 MM HEPES - NaOH 산도 7.4, 150 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl 2, 1.8 MM CaCl 2)
- Collagenase D 솔루션 : Collagenase D : 100 MG / ML (Collagenase D> 0.15 U / MG) HEPES에서 버퍼
- DNase I 솔루션 : 20,000 U / ML DNase I
- 산도 7.2에서 PBS 버퍼
- PEB 버퍼 : 20 부품 1 부품 BSA 주식 솔루션 Rinsing 솔루션 autoMACS
- 조직 : 인접한 장기 무료 7분의 6 week 오래된 성인 여성 BALB / C 마우스에서 파생된 폐.
- 옵션 : CD11c MicroBeads, 맥 MS 열, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포의 격리 Mac 용 세퍼레이터
2. 폐 조직을 Dissociating
- 적혈구를 제거하는 PBS가 포함된 배양 접시에있는 조직을 씻어.
- 4.9 ML의 HEPES 버퍼를 포함하는 gentleMACS C 튜브 450 MG의 폐 조직의 최대 전송합니다.
- 2 MG / ML Collagenase D.의 최종 농도 100 μL Collagenase D 솔루션 추가
- 150 MG 조직 (40 U / ML DNase I의 최종 농도) 또는 150-450 MG의 폐 조직을 20 μL DNase I (80 U / ML DNase I의 최종 농도)에 10 μL DNase I 솔루션을 추가합니다.
- 단단히 C 튜브를 닫고 gentleMACS의 Dissociator에 그것을 연결합니다. 그런 다음 프로그램 "m_lung_01"를 실행합니다.
- 37 30 분 품어 ° C 자동 또는 수동으로 회전마다 5 분 터닝과 함께.
- gentleMACS의 Dissociator에 샘플을 반환하고 프로그램 "m_lung_02"를 실행합니다.
3. 여과법
- 70 μm의 메쉬 셀 스트레이너와 뚜껑을 교체하여 필터링 세포를 수집하기 위해 50 ML 튜브를 준비합니다.
- 일단 두 번째 gentleMACS 프로그램이 튜브의 샘플 자료의 배포에 따라 종료, 당신은 튜브 하단의 샘플 자료를 수집하기 위해 간단히 튜브를 원심 수 있습니다.
- 적당한 1,000 μl 피펫 팁을 사용하여 C 튜브의 심장 봉인 캡을 통해 세포를 제거하고 세포 스트레이너에게 적용됩니다.
- RT에서 5 ML HEPES 버퍼와 셀 스트레이너 씻으십시오.
- 10 분 300xg에서 50 ML 튜브의 펠렛에 세포를 원심 분리기.
- 뜨는을 기음과 PEB 버퍼의 원하는 볼륨의 세포 펠렛을 resuspend.
4 부 : 대표 결과 :
그림 1. gentleMACS ™ Dissociator과 폐 분리가 92% 가능한 세포의 결과. 죽은 세포는 찬란 propidium 요오드화물의 (PI) (; 없음 PI의 얼룩 왼쪽 도트 플롯 바로 도트 플롯)와 스테인드되었습니다.
그림 2. 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율의 gentleMACS의 Dissociator 결과를 사용하여 마우스 폐 조직의 해리. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 유동세포계측법에 의해 분석되었다.
그림 3. 마우스 폐 조직에서 파생된 단일 셀 정지 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 마우스 CD11c 낮은 M - PDCA - 1 + plasmacytoid의 DC가뿐만 아니라 CD11c 높은 세포를 감지하는 물들일했다.
그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS 구분 기호와 두 MS 열을 사용하여 돌기 세포의 농축.