마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

요약

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

초록

신경계 내에의 연결 및 glial 세포 유형의 수백이 설명되었습니다. 뇌 또는 척수의 각 특정 세포 유형은 세포 표면 분자, 또는 그것이 식별하고 특성화 할 수있는을 통해 분자 determinants의 레파토리가 있습니다. 현재, 강력한 세포 식별 및 분리 기술은 동시에 특성 표면 단백질의 세포 죽음과 파괴를 제한하면서 단일 셀 준비가 생성해야합니다. 항원 epitopes을 보존하고 셀 손실을 제한하면서 트립신 또는 papain 기반 분리 키트와 함께 사용 gentleMACS Dissociator는 효과적이고 부드럽게 뇌 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. 단일 셀 suspensions의 표준화 준비는 C 튜브 및 최적화, 미리 gentleMACS 프로그램을 사용하여 이루어진다. 일단 생성, 단일 셀 suspensions는 신경 progenitors을 식별하거나, Myelin 제거 비즈를 사용하여 더욱 정화 방지 Prominin - 1 MicroBeads 같은 단클론 conjugates로 치료하실 수 있습니다.

프로토콜

무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.

1. 자료

• 신경 조직 분리 키트 (P) (구성 : 솔루션 1,2, 3, 4, 스토리지 버퍼)
• 사전 분리 필터
• (선택 사항) Myelin 제거 비즈
• 베타 - 메르 캅 토 에탄올
• gentleMACS Dissociator
• C 튜브
• MACSmix 튜브의 회전
• HBSS (W / O)
• HBSS (W)

1. 이전 프로토콜을 시작하려면 다음 솔루션을 준비 :
   1. 이가의 양이온없이 행크스 '버퍼 소금 솔루션 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +} (HBSS (W / O)
   2. HBSS, 표준, 즉 칼슘 ^{2 +와} MG ^{2 +} (HBSS (W)
2. 이후 애플 리케이션에 대한 관심의 항원 에피토프에 따라 중 Papain 기반의 신경 조직 분리 키트 (P) 또는 트립신 기반의 신경 조직 분리 키트 (T)를 사용합니다.
3. 신경 조직 분리 키트에서 다음 솔루션을 준비 :
   1. 해결 방법 2 : 0.067 mm까지 베타 메르 캅 토 에탄올을 추가
   2. 솔루션 4 : 0.7 ML 저장소 버퍼 (키트에서 제공)에 분말을 용해, 부드럽게 (소용돌이하지 않음) 믹스
   3. 효소 배합 1 : C 튜브와 10-15 분 부화에 피펫 1.9 ML 솔루션이 50 μl 솔루션 1 (키트에서 모두) 37 ° C. 이것은 뇌 조직을 떼어 놓다 400 밀리그램하기에 충분합니다.

2. 신경 조직을 Dissociating

1. 1 ML HBSS (W / O)이있는 튜브의 뇌 조직을 달다
2. preheated 효소 혼합 1 1,950 μL를 포함하는 C 튜브에 마우스 머리를 전송합니다. (참고 :이 프로토콜은 ≤ 400 밀리그램에 대한 기록이지만, 솔루션 볼륨 C 튜브마다 뇌 조직의 1600 MG 최대 수용 확장할 수 있습니다)
3. gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_01"를 실행합니다.
4. 37 15 분에 대한 회전 (MACSmix 튜브의 회전을 사용하여 4 RPM)를 품어 ° C.
5. gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_02"를 실행합니다.
6. 분리 단계 동안 부드럽게 솔루션 솔루션 3 사 10 μl 20 μl를 혼합하여 조직의 400 밀리그램 당 효소 혼합이 30 μl를 준비합니다.
7. 심장 - 봉인 캡을 통해 C 튜브에 효소 혼합 2 추가하고 vortexing없이 부드럽게 섞는다.
8. 37 C 튜브 10 분에 대한 회전 ° 배양기에서 C를 품어.
9. gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_03"를 실행합니다.
10. 37 C 튜브 10 분에 대한 회전 ° 배양기에서 C를 품어.
11. 튜브의 하단에있는 샘플을 수집하기 위해 간단히 원심 분리기.

3. 여과법

1. 관심의 세포 통로를 허용하도록 필터 큰만큼을 선택합니다. 예를 들어, Purkinje 세포는 30 μm의 필터를 통과하기에는 너무 큰 있지만, Prominin - 1 + 세포는 것입니다.
2. 세포를 제거하는 suitable1000 μl 피펫을 사용 심장 - 봉인 캡을 통해 C 튜브를 형성하고 15 ML 수집 관의 사전 분리 필터를 적용해야합니다. (참고 : 큰 샘플 크기는 50 ML 수집 관을 사용하는 경우).
3. HBSS (W) 10 ML과 필터를 씻으십시오.
4. RT 10 분 300 XG에서 필터링된 세포를 원심 분리기.
5. 후속 응용 프로그램에 대한 중간 또는 선택의 버퍼에 supernatent을 Resuspend.
6. myelin의 파편을 제거하려면, Myelin 제거 비즈를 사용합니다.

4. 대표 결과 : 숫자 1-3를 참조하십시오

그림. gentleMACS의 Dissociator 1 뇌 분리는 흐름 cytometric 분석이 보여주는 것처럼, 97% 가능한 세포의 결과.

그림. neurosphere 형성 2 라이트 현미경 사진은 자기 세포 정렬 후 맥의 재배 7 일 후 안티 Prominin - 1 MicroBeads를 사용하여 ® NeuroMedium는 맥에서 보충 B27 플러스와 함께 보충. 세포는 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용 CD1 마우스 뇌 (P3)에서 준비되었다.

그림. 단일 셀 suspensions 3 Myelin의 파편이 상당히 세포 절연 impairs 및 Myelin 제거 비즈로 myelin 파편의 제거 효율 전지 분판을 증가시킵니다. 안티 Prominin - 1 MicroBeads을 사용하여 Mac에서 분리 들어, P22 마우스 두뇌 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용하여 dissociated되었습니다. 단일 세포 현탁액의 세포가 직접 분리에 사용되었다, 또는 Myelin 제거 비즈를 사용하여 고갈을 myelin에 제출했다. , myelin 제거없이 함께 시료의 분리를 비교하면 순수 이전 myelin 제거와 함께 샘플 높다는 것을 설명합니다.

토론

gentleMACS Dissociator는 닫힌 시스템에서 신경 조직에서 단일 셀 suspensions의 표준 준비를 용이하게합니다. 신경 조직 분리 키트는 immunostainings 및 immunomagnetic 세포 분리 ^1-5와 같은 추가 응용 프로그램에 필요한 항원 epitopes을 보존하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜에서는 97% 가능한 세포에 항복, gentleMACS Dissociator과 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용하여 마우스 두뇌의 부드러운 효소 분해를 보여줍니다. 5x10 ⁶ 호스트 조직의 연령에 따라 1x10 ⁷ 세포 사이에 신경 조직 수익률 100 MG. 대상 Prominin - 1 ⁺ 세포는 안티 Prominin - 1 MicroBeads를 사용하여 절연하고 이후 문화로 이동했다. 프로토콜은 쥐> P7에서 파생된 신경 조직과 함께 작업할 때 Myelin 제거 비즈의 추가 사용 훨씬 더 효과적으로 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C 튜브	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ 시작 키트	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ 튜브 회전기	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-090-753	<제시된 텍스트가 없으므로 번역할 내용이 없습니다. 번역이 필요한 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
신경 조직 해리 키트 (P)	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-092-628	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
분리 전 필터	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-092-333	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-092-335	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-094-544	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 리치 파이펫 팁	분자 생물학 제품	주문 번호 2079	http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61<멸균 상태에서 작업하기 위해 모든 단계를 라미나 플로우 후드(laminar flow hood) 내에서 수행하는 것을 권장합니다. 1. 재료 신경 조직 해리 키트 (Neural Tissue Dissociation Kit) (P) (구성품: 용액 1, 2, 3, 4, 보존 완충액) 분리 전 필터 (Pre-Separation Filters) (선택 사항) 미엘린 제거 비즈 (Myelin Removal Beads) gentleMACS Dissociator C 튜브 MACSmix 튜브 회전기 (Tube Rotator) HBSS (w/o) HBSS (w) 프로토콜을 시작하기 전 다음 용액들을 준비하십시오: 2가 양이온 $\text{Ca}^{2+}$ 또는 $\text{Mg}^{2+}$가 포함되지 않은 Hanks’ Buffered Salt Solution (HBSS (w/o)) 표준 HBSS, 즉 $\text{Ca}^{2+}$ 및 $\text{Mg}^{2+}$가 포함된 것 (HBSS (w)) 후속 응용 단계에서 관심 있는 항원 에피토프에 따라 파파인(Papain) 기반 신경 조직 해리 키트(P) 또는 트립신(Trypsin) 기반 신경 조직 해리 키트(T) 중 하나를 사용하십시오. 신경 조직 해리 키트로 다음 용액들을 준비하십시오: 용액 2: $\beta$-mercaptoethanol을 $0.067\text{ mM}$ 농도로 첨가합니다. 용액 4: 분말을 $0.7\text{ mL}$의 보존 완충액(키트에 제공됨)에 녹이고 부드럽게 혼합합니다(볼텍싱 금지). 효소 혼합액(Enzyme Mix) 1: C 튜브에 용액 2 $1.9\text{ mL}$와 용액 1 $50\text{ \mu L}$(모두 키트 제공품)를 넣고 $37\text{ °C}$에서 $10\sim15$분 동안 배양합니다. 이 양은 뇌 조직 $400\text{ mg}$을 해리하기에 충분합니다. 2. 신경 조직 해리 $1\text{ mL}$의 HBSS (w/o)가 들어 있는 튜브에서 뇌 조직의 무게를 잽니다. 마우스 뇌를 미리 가열된 효소 혼합액 1 $1950\text{ \mu L}$가 담긴 C 튜브로 옮깁니다. (참고: 이 프로토콜은 $400\text{ mg}$ 이하를 기준으로 작성되었으나, C 튜브당 최대 $1600\text{ mg}$의 뇌 조직을 처리할 수 있도록 용액 부피를 조절할 수 있습니다.) C 튜브를 gentleMACS Dissociator에 넣고 “m_brain_01” 프로그램을 실행합니다. MACSmix 튜브 회전기를 사용하여 $37\text{ °C}$에서 $15$분 동안 회전 배양($4\text{ rpm}$)합니다. C 튜브를 gentleMACS Dissociator에 넣고 “m_brain_02” 프로그램을 실행합니다. 해리 단계 동안, 용액 3 $20\text{ \mu L}$와 용액 4 $10\text{ \mu L}$를 부드럽게 혼합하여 조직 $400\text{ mg}$당 $30\text{ \mu L}$의 효소 혼합액 2를 준비합니다. 셉텀 밀폐 캡(septum-sealed cap)을 통해 효소 혼합액 2를 C 튜브에 넣고 볼텍싱 없이 부드럽게 혼합합니다. 인큐베이터 내에서 $37\text{ °C}$로 $10$분 동안 회전 배양합니다. C 튜브를 gentleMACS Dissociator에 넣고 “m_brain_03” 프로그램을 실행합니다. 인큐베이터 내에서 $37\text{ °C}$로 $10$분 동안 회전 배양합니다. 짧게 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥에 모읍니다. 3. 여과 관심 세포가 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰 필터를 선택하십시오. 예를 들어, 푸르키네 세포(Purkinje cells)는 너무 커서 $30\text{ \mu m}$ 필터를 통과할 수 없으나, Prominin-1+ 세포는 통과합니다. 적절한 $1000\text{ \mu L}$ 피펫을 사용하여 셉텀 밀폐 캡을 통해 C 튜브에서 세포를 제거하고, 이를 $15\text{ mL}$ 수집 튜브 위의 분리 전 필터에 적용합니다. (참고: 샘플 크기가 더 큰 경우 $50\text{ mL}$ 수집 튜브를 사용하십시오.) $10\text{ mL}$의 HBSS (w)로 필터를 세척합니다. 여과된 세포를 실온(RT)에서 $300\text{ x g}$로 $10$분 동안 원심분리합니다. 상층액을 후속 응용 단계에 사용할 적절한 배지 또는 완충액에 다시 현탁합니다. 미엘린 잔해를 제거하려면 미엘린 제거 비즈를 사용하십시오. 4. 대표 결과: 그림 1-3 참조 그림 1. 유세포 분석 결과, gentleMACS Dissociator를 이용한 뇌 해리 시 세포 생존율이 $97\%$로 나타났습니다. 그림 2. MACS Supplement B27 PLUS가 첨가된 MACS® NeuroMedium에서 $7$일간 배양 후, Anti-Prominin-1 MicroBeads를 이용한 자기 세포 분리를 통해 형성된 뉴로스피어(neurosphere)의 광학 현미경 사진입니다. 세포는 신경 조직 해리 키트(P)를 사용하여 CD1 마우스 뇌(P3)에서 준비되었습니다. 그림 3. 단일 세포 현탁액 내의 미엘린 잔해는 세포 분리를 상당히 저해하며, 미엘린 제거 비즈로 미엘린 잔해를 제거하면 세포 분리 효율이 증가합니다. Anti-Prominin-1 MicroBeads를 이용한 MACS 분리를 위해, 신경 조직 해리 키트(P)를 사용하여 P22 마우스 뇌를 해리했습니다. 단일 세포 현탁액의 세포를 직접 분리에 사용하거나 미엘린 제거 비즈를 사용하여 미엘린 결핍 처리를 하였습니다. 미엘린 제거 전후의 샘플을 비교한 결과, 이전에 미엘린을 제거한 샘플의 순도가 더 높음을 알 수 있습니다.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
신경 조직 해리 키트 (T)	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-093-231	<제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주세요."http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
프로피듐 아이오다이드 용액	Miltenyi Biotec	주문 번호 130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx