개별적으로 흩어져 셀의 우위와 세포학 표본에서 셀 블록 준비

소개 :

이것은 HistoGelTM (써모 과학) (HG)를 사용하여 액체 기반 세포학 (LBC) 표본에서 셀 블록 준비 Shidham의 방법을 설명하는 동영상입니다. 다른 임의의 접근법에 비해 다음은이 프로토콜의 두 가지 중요한 기능은 단독으로 흩어져 느슨한 세포 (1-5)과 상대적으로 hypocellular 표본에서 셀 블록을 준비하고 있습니다.

1. 이 프로토콜은 셀 블록의 절단 표면에 평행하게 비행기 따라 세포를 집중하는 단계를 포함한다.
2. 또한 다음과 같은 목적으로 두 가지를 제공 AV - 마커 (그림 1B)의 등대 같은 어두운 포함을 포함 :
   1. 세포가 집중되는의 수준을 시각화합니다. 어두운 색 신호를 절단하는 동안 노출되었을 때 관심의 세포와 세포 블록의 면적은 현재 histotechnologist에 의해 시각 수 있습니다. 모니터 이러한 능력은 세포의 대부분 수준으로 절단하거나, 샘플 세포의 높은 농도와 수준에 너무 피상적인 절단하지에서 하나를 방지합니다.
   2. 다른 슬라이드에 직렬 셀 블록 섹션에 위치 참조 지점 역할을합니다. 이 기준점은 스키피오 접근 (6,7)와 좌표 immunoreactivity 패턴의 평가를위한 세포의 특정 세포 또는 그룹을 찾을 수 있도록 신호기 역할을합니다.

프로토콜 (그림 2)

샘플 준비.

1. 평평한 바닥 유리관 (15mm 직경 X 45mm) (2.4를 통해 그림 2.1)에 잔여 LBC 자궁 경부의 세포학 표본을 전송합니다. 큰 플라스틱 캐리어 튜브 (28 X 85mm)과 원심 분리기에 유리 튜브를 놓습니다. 캐리어 튜브에서 유리 바닥 튜브를 제거하고 표면에 뜨는를 부어.
2. 유리관은 다음 뒤덮힌 (다음 단계에서 가열 물을 spillage을 방지하기 위해)와 큰 평면 바닥 캐리어 플라스틱 튜브 안으로 배치됩니다
3. 유리 튜브를 포함하는 캐리어 플라스틱 튜브 그러면, 덮인 원심 분리기에 배치 (세포가 유리관의 평평한 바닥에 수직으로 떨어질 수 있도록 선회 컵 아닌 고정 각도 컵을 함께), 그리고 1805에서 G (3000 RPM으로 늘인입니다 로터 반경 - 17cm) 오분 (그림 2.5)에 대한.
4. 튜브는 다음 원심에서 수직으로 제거하고 작은 유리관은 세포와 sedimented 펠렛을 방해하지 않고 더 큰 캐리어 플라스틱 튜브에서 집게로 제거됩니다.
5. 표본있는 유리관이 uncapped되고 뜨는은 하단에있는 침전물 세포의 평면 계층 (그림 2.6) 방해하지 않도록 돌봐 해제 붓고있다.

참조 좌표 AV - 마커의 포함과 더불어 젤

1. 어두운 신호를 AV - 마커 (약 2mm X 2mm 크기, 평면은 어두운 색, sectionable 소재 조각, 표면) (그림 3)은 유리관에 푯말 (그림 2.7)로 추가됩니다.
2. 중간 전력 10 초 동안 전자 레인지에 용해하여 HG의 나누어지는을 녹일.
3. 빨리 퇴적물과 튜브, 믹스로 용융 HG 0.5 ML를 추가하고 (HG는 응고 시작 수 있도록하지 않고 신속하게 다음 단계로 진행) (그림 2.8)을 해드리겠습니다.
4. 의 약 2.5 ML를 추가 따뜻한 (45 ° C) 캐리어 플라스틱 튜브에 물 (그림 2.9).
5. 작은 덮인 유리 튜브는 따뜻한 물로 플라스틱 튜브 안에 저장됩니다. (이 단계는 다음 단계 동안 응고의 HG를 유지하는 데 필요한 것입니다) (그림 2.9).
6. 캐리어 플라스틱 튜브 (세포가 유리관의 평평한 바닥에 수직으로 떨어질 수 있도록 선회 컵 아닌 고정 각도 컵 포함) 원심 분리기에 배치하고, 다섯을위한 1805에서 G를 (3000 RPM으로, 로터 반경 - 17cm) 늘인입니다 분. 이 원심 분리 단계의 목적은 AV - 마커를 밀고하고 가까이 최종 파라핀 임베디드 셀 블록 (그림 1D)의 절단 표면에 레이어로 세포를 집중하는 것입니다.
7. 튜브 그런 다음 하단에있는 샘플 세포와 sedimented 얇은 레이어를 방해하지 않도록 돌봐 원심에서 부드럽게 수직으로 제거됩니다.
8. 큰 플라스틱 튜브 uncapped되고 작은 유리관은 표본 세포의 퇴적물 층을 교란하지 않고 포셉에 의해 수직으로 제거됩니다.
9. 작은 유리관은 근사하고 HG (그림 2.11)을 응고 15 분 동안 수직 위치에 냉장 있습니다.

최종 처리를위한 시료로 젤의 버튼으로 셀 블록 제거

1. 바닥에 침전물 / 집중 시편의 레이어로 확정 H​​G 디스크는 주사기 (그림 2.12)와 23 게이지 바늘을 통해 포르말린 10 % squirting하여 평면 바닥 유리관에서 dislodged 수 있습니다.
2. 바늘은 표본 (그림 2.12)와 확정 H​​G 디스크의 주변에있는 튜브의 측면을 따라 삽입됩니다.
3. needl포르말린은 천천히 주사기를 통해 밀려있는 동안 전자는 튜브의 측면을 따라 회전합니다. 어두운 색 신호를 AV - 마커와 유리관의 평평한 바닥 (그림 2.12)에서에 집중 표본과 함께 HG 버튼의 분리에서 발생합니다.
4. 셀 블록 (표본 세포로 겔 버튼) 다음 표시 카세트에 위치하고 파라핀 임베디드 셀 블록 (그림 2.13)를 준비하는 조직 처리를위한 제출합니다.

포함하고 시편의 절단

1. 디스크 표면 가공으로 다운 어두운 비콘 마커 사이드 (그림 1)과 파라핀에 모두 담겨있다.
2. 신호를 노출하고 명확하게 볼 수 있습니다와 같은 블록은 어두운 색깔 마커까지 AV - sectioned입니다.
3. 서너 마이크론 섹션은 표본에서 단독으로 흩어져있는 세포의 대부분을 포함한다이 수준에서 절단됩니다.
4. 섹션이 추가로 얼룩, immunohistochemical 얼룩, 또는 표시 다른 시험은 유리 슬라이드에 저장됩니다. 섹션을 장착에 사용할 슬라이드의 유형을 포함하여이 테스트를위한 프로토콜이 다를 수 있습니다. 일반적으로 immunostaining위한 코팅 슬라이드는 immunostaining 단계 중에 부유하고 슬라이드에서 섹션의 손실을 방지하는 데 사용됩니다.

(알파벳 순서) 사용 약어 : CISH, 원위치 하이브리드화 시험 chromogenic, 생선, 형광등 원위치 하이브리드화 시험, FFPE, 포르말린 - 고정 파라핀 - 임베디드, FNA, 괜찮 바늘 흡인, HG, HistoGel ™ (써모 과학); LBC, 액체 기반 세포학, PCR 효소의 연쇄 반응;

그림 1. 셀 블록의 구조는 Shidham의 프로토콜에 의해 준비.

그림 2. Shidham의 프로토콜에 의해 LBC 표본에서 셀 블록을 준비 서로 다른 단계의 요약.

그림 3. 바나나 껍질에서 AV - 마커의 작성.

그림 4.와 AV - 마커없이 셀 블록 및 섹션의 비교.

그림 5. AV - 마커과 않고 셀 블록 섹션의 cellularity 비교.

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).