방법 논문

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

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DOI:

10.3791/1373

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2009년 10월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

이 논문에서

요약

이 비디오에서는 소개 예 생체내 생성 및 확장 (CD40 - B).

초록

CD40 - 활성화된 B 세포는 (CD40 - B 세포) 단백질 stimulatory 항원 제시 암 immunotherapy에 대한 세포 (APC하는) 1-3의 대체 소스로 확인되었습니다. CD40 - B 세포가 여러 가지 서로 다른 생물 학적 및 기술적 특성을 가지고 돌기 세포 (DCS), 최고의 특징 APC, 비교. DC가 마찬가지로, B 세포는 MHC와 공동 stimulatory 분자 (Fig.1b)의 증가 표현을 표시, 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극 후 강력한 철새 용량과 효율적인 T 세포에 존재 항원 프레 젠 테이션을 나타냅니다. 그러나, 미숙 또는 성숙 DC가와는 대조적으로, CD40 - B 세포는 CD62L, CCR7/CXCR4 이루어진 전체 림프절 유도 깡패을 표현하고, 보조 림프 기관으로 유도하기 위해 필요한 백혈구 기능 항원 - 1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3. CD40 - B 세포는 더욱 높은 순수 CD40 - B 세포를 건강한 기증자로부터 (> 10 9 환자 당 세포)뿐만 아니라 암 매우 다량으로 체외로 확장시킬 수 말초혈 매우 소량의 어려움없이 생성할 수 있습니다 환자 (Fig.1c, D) 1,4.

이 프로토콜에서 우리는 인간의 PBMC에서 완벽하게 작동 CD40 - B 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 세포 배양을위한 주요 분자는 CD40 리간드, 인터루킨 -4 (IL - 4) 및 시클 로스 포린 A (CSA), 3~4일 문화주기에 보충함하는. 아르 실험 목적 CD40 - 자극은 재조합 인간 CD40 리간드 (tCD40L NIH/3T3) 5을 표현 NIH/3T3 세포에 의해 제공됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에있는 인간 CD40 리간드 표현 (Fig.2) 정기적으로 확인되어야한다.

십사일 후 CD40 - B 세포 배양 이상 순도 95 프로지 B 세포 65 일 동안 CD40 - B 세포의 확장 기능을 1, 4의 손실없이 자주이 가능합니다 구성되어 있습니다. CD40 - B 세포가 효율적으로 프로세스를 차지하고 T 세포에 항원 제시 6. 그들은 소수 naϊve 모르지만, 또한 메모리 T 세포에게 7,8를 확장합니다. CD40 - 활성화된 B 세포는 B - 세포 활성화, 차별과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 구 예방 접종을위한 유망한 도구를 나타냅니다.

프로토콜

PBMC에서 인간 CD40 - 활성 B 세포의 생성에 대한 프로토콜은 두 부분으로 나뉘어져 있습니다 : 제 플레이트 - 바운드 피더 세포로 사용됩니다 NIH/3T3 세포를 표현 CD40 리간드의 준비를 보여줍니다. 파트 B는 실제 CD40 - B 문화를 설명합니다.

피더 세포의 A. 준비 (tCD40L NIH/3T3)

tCD40L NIH/3T3 완전히 합류가해서는 안 자기편 murine fibroblast 세포 라인입니다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다.

  1. 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음.
  2. 37 5-10분에 75cm 2 플라스크 4 ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다.
  3. 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 부드럽게 회전.
  4. 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운.
  5. 뜨는을 제거하고 야생 유형 매체 10 ML에서 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 카운트하고 세포의 적절한 수의 세 50 ML 튜브를 준비 :
    1. subculturing에 대한 1.5 X 10 6 세포
    2. 0.2 X 10 6 세포 / 잘 CD40 - B 세포 배양에 사용되는 방사선에 대한
    3. 프리즈에 나머지 (필요한 경우).
  6. 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운.
  7. 뜨는을 제거합니다.
    1. subculturing 들면 : resuspend 1.5 75cm 2 세포 배양 플라스크 10 ML 야생 유형 매체 (세포 밀도가 1.5 X 10 5 셀 / ML)에서 X 10 6 세포, G - 418을 추가 [0.7 MG / ML]와에있는 세포를 품어 5% CO 2와 37 ° C. 두 당 주 세포를 분리.
    2. CD40 - B 세포 배양의 경우 : 한 6 자 접시 1.2 X 10 6 세포가 필요합니다. 0.1 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 야생 유형의 매체에있는 세포를 Resuspend하고 78 쥐에서 그들을 비추다. 물론 각 37에서 그들을 품어 ° C와 5 % CO 2에 세포 현탁액의 플레이트 2 ML. tCD40L NIH/3T3 세포가 자기편 때 B - 세포 자극이 준비한 접시를 사용합니다 (최소한 4 시간 : 현미경으로 준수를 확인, B - 세포 자극을 시작하는 이상 24 H를 기다리지 않는다). (B. 계속)

B. CD 40의 B 세포 배양

CD40 - 자극 (일 공)에 대한 PBMCs의 I. 준비 :

주의 : 당신이 피더 세포가 자기편 것을 확인할 계속하기 전에. 항상 인터루킨 - 4 및 시클 로스 포린의 성장 매체 바로 사용하기 전에 새로운 솔루션을 추가합니다.

  1. 신선한 또는 적절하게 해동 중 하나를 PBMCs 가져가라. Resuspend 그들을 씻고 7 분 및 기타 세포를 제거 7 분 190 XG에서 두 번째 시간에 265 XG에 처음 스핀 다운을 1X PBS의 50mL 두 번 PBMCs. 뜨는을 취소하고 PBS 20 ML에있는 세포를 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 확인합니다.
  2. 5 분 225 XG에서 세포의 필요한 양을 스핀 다운. 6 잘 플레이트 4 X 10 6 세포 / 잘 따라서 판 당 24 X 10 6 셀 필요합니다.
  3. 뜨는를 제거하고 성장 요인 및 0.63 μg / ML 시클 로스 포린과 같은 A는 T - 세포의 파생물을 방지하기 위해 갓 50 U / 인터루킨 - 4의 ML과 보충 CD40 - B 문화 매체 1 X 10 6 세포 / ML에서 PBMC를 resuspend (감안할 때 농도가 한 ML 문화 매체를 참조!).
  4. 에서 뜨는을 제거 6 잘 플레이트 사전 incubated tCD40L NIH/3T3 세포와 함께.
  5. 2 ML PBS마다 잘 첫번째와 CD40 - B 세척 매체 2 ML과 함께 두 번째 단계에서 자기편 tCD40L NIH/3T3 세포를 씻으십시오.
  6. 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 잘하는 PBMC 정지 4 ML (1 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다.
  7. 37 세포를 품어 ° C와 5 % CO 2.
  8. 일 7.2에서 세포 (3.2 계속.) reculture.

II. CD40 - B 세포 (일 7 다음 모든 3~4일)의 Recultivati​​on :

  1. 50 ML 튜브에 10 ML의 피펫과 수영장 그들과 함께 resuspending하여 6 - 잘 접시에서 CD40 - B 세포의 수확 클러스터.
  2. 7분에 대한 225 XG에 스핀 다운 및 완전히 CD40 - B 세척 매체로 뜨는 교체하십시오. 나누어지는의 세포 금액을 계산하는 동안, 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운. 1 X 10 6 세포 / ML의 농도에서 CD40 - B 문화 매체 Resuspend CD40 - B 세포.
  3. 50 U / ML의 농도와 매체 0.63 μg / ML 시클 로스 포린의 인터루킨 - 4의 새로운 솔루션을 추가합니다.
  4. 6 잘 플레이트 tCD40L NIH/3T3 세포 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다.
  5. 2 ML PBS마다 잘 첫번째와 CD40 - B 세척 매체 2 ML과 함께 두 번째 단계에서 자기편 세포를 씻으십시오.
  6. 을 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 잘하는 CD40 - B 정학 4 ML (1 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다.
  7. 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2.
  8. Subculture 세포가 다시 모든 3-4일 14 일 총 후에 고도로 순수한 인간 CD40 - B 세포 활성화와 최종 수 있습니다.

C.의 문제 해결 - 뭐 CD40 - B 세포 성장하지 않으면?

  1. 당신은 피더 세포의 CD40 리간드 발현에 대한 검사 있습니까?
  2. 판 - 바운드 자극에 사용되는 피더 세포는 24 시간 이상은 안하나요?
  3. mycoplasma 수있는 오염인가?
  4. 보완을 위해 사용되는 인터루킨 - 4 솔루션은 갓 해동하고 적절한 생물 학적 활동을했다나요?
  5. 시클 로스 포린 A는 정확한 농도에 추가습니까?

figure-protocol-1
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figure-protocol-2
그림 2.하세요 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 위해.

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재료

미디어 A. 준비 :

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
피더 세포 야생 유형 매체 피더 셀 선택 매체
시약 집중 시약 집중
DMEM - 햄의 / F12 DMEM - 햄의 / F12
L - 글루타민 365 μg / ML L - 글루타민 365 μg / ML
FBS 10% FBS 10%
HEPES 10 MM HEPES 10 MM
Gentamycin 15 μg / ML Gentamycin 15 μg / ML
G - 418 0.7 MG / ML
CD40 - B 세척 매체 CD40 - B 문화 매체
시약 집중 시약 집중
IMDM
IMDM
L - 글루타민 584 μg / ML L - 글루타민 584 μg / ML
HEPES 25 MM HEPES 25 MM
Gentamycin 15 μg / ML Gentamycin 15 μg / ML


RH 트랜스페린 50 μg / ML


RH 인슐린 5 μg / ML


AB - Humanserum 10%

B. 기타 시약 :

시약 회사 아니오를 주문하지
DMEM / 햄의 F12 PAA 고양이 번호 : E15 - 813
IMDM Invitrogen Gibco ® REF 21980-032
Dulbecco의 PBS (10X) PAA 고양이도없는 H15 - 011
AB - 인간 혈청 Invitrogen 고양이도없는 34,005,100
홀로그램 트랜스페린 인간 시그마 고양이도없는 T0665
인슐린 인간 시그마 고양이도없는 I2643
Gencin ® 델타 선택 예술 없음 7,395,800
재조합 인간 인터루킨 - 4 Immunotools 고양이도없는 11,130,045
시클 로스 포린 노바티스 고양이도없는 NDC 0078-0109-01
FBS LONZA 고양이도없는 DE14 - 802C
HEPES 버퍼 PAA 고양이도없는 S11 - 001
G - 418 황산염 PAA 고양이도없는 P02 - 012
트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) Invitrogen Gibco ® REF 15400-054

C. 기타 용품 :

시약 회사 아니오를 주문하지
멸균 피펫 팁 Sarstedt
6 - 웰 플레이트 NUNC 고양이도 140,675
50mL 원뿔 관 BD 팰컨 ™ 고양이도 352,070
조직 문화 플라스크 SARSTEDT 고양이도없는 83.1813.002

참고문헌

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

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CD404ANIH 3T3

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