Method Article

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자연 미생물의 대부분은 현재 전통적인 재배 방식에 액세스할 수 남아 있습니다. 지난 10 년간, 문화, 독립적인 환경 게놈 (

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosmid 라이브러리 구축은 네 가지 주요 단계와 여러 부분 (개요에 대한 Fig.1 참조)로 하위 분할로 나뉘어있다.

([3] "0.22 μm의 Sterivex 필터에서 DNA 추출"프로토콜을 참조) I 단계

1 부 : 효소 - 촉매 세포 용해

2 부 : CsCl 밀도 기울기 원심 분리와 DNA의 회복에 의해 환경의 DNA 정제

파트 3 : 겔 전기 영동에 의해 추출한 DNA의 품질 관리

단계 II

1 부 : 복구 환경의 DNA 효소 수정 단계

환경 DNA의 최종 수리 단계에 필요한 모든 시약은 EPICENTRE에서 pCC1 Fosmid 라이브러리 제작 키트에 포함되어 있습니다. 이상적으로, 당신의 게놈 DNA는 0.5 μg / μl로 조정해야합니다.

  1. 얼음의 모든 시약을 녹여 다음을 조합하여 간략하게 아래에 모든 액체를 얻을 수있는 튜브를 원심 분리기 :
    • X μl 멸균 물
    • ....

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Discussion

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절차는 가장 효율적으로 해안 물 샘플에서 파생된 게놈 DNA와 큰 삽입 fosmid 라이브러리를 생성하는 방법을 설명합니다. 업 - 스트림 게놈의 DNA 추출은 별도의 프로토콜 [3]에 설명되어 있습니다.

fosmid 라이브러리 생산 다단계 프로세스, 계획 네 명 모두 제공 단계를 포함하여 모든 절차에 시간에 최소한 2~3주 때문입니다. 게놈 DNA의 추출은 가장 중요한 단계와 단계를 추출한 게놈 DNA의 품질과 수량에 의존하는 모든 다운 스트림이며 때문에이 단계에 대한 충분한 시간을 보내는 고려하여 신중하게 작동합니다. 품질 및 추출한 DNA의 수량 조절은 매우 중요합니다. 이것이 당신이 만들려고하는 첫번째 라이브러리 특히 그것은 fosmid 클론의 숫자가 낮은 것을 발생할 수 있습니다. 자체 fosmid 라이브러리 건설 정직 한, 실패는 주로 귀하의 추출 및 정제 게놈 DNA의 부족 품질 및 / 또는 수량에 의해 발생합니다. 게놈 DNA를 다시 추출하여 도서관 공사가 성공.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
나는 공개 없어요.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT와 SL은 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 장학금으로 지원했다. MT 또한 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 화목 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<강력한>단계 II
CopyControl™ Fosmid 라이브러리 생산 키트, Epicentre Biotechnologies,9-10개의 Fosmid 라이브러리를 생성하기에 충분한
SeaPlaque, Agarose,Cambrex, 50100
교반 핫 플레이트CorningPC-420D
1.0X TAE, 러닝 버퍼
CHEF Mapper, XA, 냉각 모듈 및 가변 속도 펌프를 포함한 펄스장 전기영동 시스템바이오-라드
λ DNA-HindIII 다이제New England BiolabsN3012S
미드레인지 I PFG 마커New England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
전자레인지용 플라스틱 랩Saran 프리미엄 랩
Safe Imager transilluminatorInvitrogenS37102
GELase Agarose 젤 소화 준비진원지 생명 공학G09100
메스피셔 사이언티픽08-927-5D
Amicon Ultra-4 원심 필터 장치, Ultracel-10 멤브레인EMD MilliporeUFC801024
Microcon YM-30 원심 필터 장치 EMD Millipore42410
뉴클레아제 자유 물AmbionAM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트 *2000 분석*#InvitrogenP7589
디지털 드라이 블록 히터VWR international12621-088
수조VWR international14231-854
원심분리기Beckman Coulter Inc.Avanti J-E
원심분리기 로터Beckman Coulter Inc.JA 5.3
탁상용 원심분리기Eppendorf5415D
마이크로 원심분리기 튜브, 1.7 mL, 투명Axygen ScientificMCT-175-C
15 mL 원심분리기 튜브 Fisher Scientific430052
Step III
LB 육수Fisher ScientificBP 1426-2
MgSO4Sigma-AldrichM2643
파지 희석 완충액10mM Tris-HCl[pH 8.3], 100mM NaCl, 10mM MgCl2
cryogenic 바이알Fisher Scientific430488
Step IV
96 웰 플레이트(뚜껑 포함)Fisher ScientificCS003370( 3370)
384 뚜껑이 있는 웰 플레이트Fisher Scientific07201157(3680)
페트리 접시 100 O.D. x 15mm HFisher Scientific08-757-12
페트리 접시 150 Dia. x 15mmHFisher Scientific08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mmVWR 국제CABD351040
글리세롤Sigma-AldrichG5516
클로람페니콜시그마-알드리치C0378
LB 육수Fisher ScientificBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
유리 구슬Fisher Scientific10-310-1
QFill3GenetixX3050
표백제Javex
에탄올Sigma-AldrichE7023
15mL 원심분리기 튜브Fisher Scientific430052
QPix 콜로니 피커GenetixQPix2
피킹 헤드(E. coli) GenetixX4006
CCFOS110, , , ,, 스트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

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