초기 압력에 의해 Gynogenetic의 Diploid의 Zebrafish 만들기

요약

이것은 바로 자외선 - inactivated 정자와 수정 후 두 번째 meiotic 부서 차단하여 gynogenetic의 diploid의 zebrafish의 배아 (단 유전적 기여 어머니의 유래 배아)를 생성하는 방법입니다. EP의 배아는 첫 번째 meiotic 부문 중 재조합에 의해 완전히 homozygous하지 않습니다, 그러나 그들은 재조합하여 centromere에서 분리되지 않은 모든 loci에 homozygous 있습니다.

초록

diploid의 eukaryotes에 Heterozygosity 종종 유전자 연구 성가신합니다. heterozygous 여성에서 직접 가능한 homozygous diploid의 자손을 생산 방법은 F1 mutagenized 여성이 가속 앞으로 유전 화면에 해로운 돌연변이 직접 검사를 할 수 있습니다. Streisinger 외.

프로토콜

초기 압력의 개요

참고 사항 : tricaine, 생선 물 행크스 호수로이 프로토콜에서 사용되는 시약의 많은 요리법 Zebrafish 도서 ^{3 조} (의 10 장에서 사용할 수있는 온라인 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )

1. UV inactivated 정자를 사용하여 체외의 수정에 의해 배아를 생성합니다.
2. 즉시 계란 물을 브림에 가득찬 유리관 (플라스틱 스냅 캡 포함)로 수정된 달걀을 전송합니다. 라텍스 고무의 얇은 시트로 유리병의 열린 끝을 커버와 고무 위에 유리병에 상단에 (구멍이 절단되어있는로) 스냅인.
3. 액압 프레스의 병을 놓고 1.4 분 배입니다 8,000 PSI (많은 프레스는 2 인치 직경 피스톤에 끼쳤다 압력을 읽을 보정되며, 그 결과가 PSI로 변환해야합니다)에 압력을 올리기
4. 수정 후 6 분 시작, 점차적으로 1 분 동안에 걸쳐 압력을 릴리스합니다.

상세 초기 압력 절차

1. 실험 전날

토론

이 방법에 의해 만들어진 배아 사실 gynogenetic의 diploids되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 컨트롤로 정상 diploid 달걀 (UV - 불활 성화없이 정자의 일부를 별도로 유지하여)와 haploid 배아 (EP 절차를 거치지 않고 UV 정자와 함께 수정된 계란의 클러치를 별도로 유지하여)의 클러치의 클러치를 생성합니다. 일일 게시물 수정의 haploid의 배아에서 짧은 몸 축, 불규칙한 두뇌와 체절의 형태 있습니다. Haploids 2-3 일 후에 가능한되지 않습니다. 어떤 불규칙 "EP 괴물"이 발생할 수 있지만, EP의 diploids은 정상 diploids 같이한다. EP의 diploids의 클러치는 (70~90%) 대부분 가능한되어야합니다. EP의 diploid 클러치에 haploids의 존재는 EP 과정에서 (예를 들어, 압력을 가질 실패 언론) 실패를 제안합니다. haploid 클러치 diploids의 존재는 불완전 정자 불활 성화 (예 : crosslinker에 실패) 제안합니다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tricaine	Sigma-Aldrich
시계 접시
프렌치 프레스(French Press)
압력 실린더
인스턴트 오션(Instant ocean)
파스퇴르 피펫			좁은 끝부분을 절단하고 화염 연마 처리
UV 가교 결합기(UV cross-linker)
미세 모세관