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방법 논문

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae

9.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/1474

⸱

2009년 10월 12일

 , 
1Institute for Systems Biology

이 논문에서

요약

cryolysis, 요소의 solubilziation, HILIC 분류 및 phosphorylated 펩티드의 아이맥 농축을 사용하여 양적 인산화 과정에 대한 설명.

초록

이 프로토콜은 isotopically 무거운 가벼운 S. cerevisiae의 세포의 지방산 oleate와, 성장과 자극을 설명합니다. 세포는 볼 밀 분쇄기 및 요소의 solubilization에 의해 솔루션으로 가져온 결과 grindate에 cryolysis 절차를 사용하여 접지합니다. 이 절차는 인산화을 보존하고 세포 용해 동안 phosphoproteome의 reorientation 방지, metabolically 비활성 상태에있는 세포의 용해를 위해 수 있습니다. 감소, 알킬화, 단백질의 트립신의 소화에 따라, 샘플은 C18 컬럼과 친수성 ​​상호 작용 크로마 토그래피 (HILIC)을 사용 분별화 감소 샘플 복잡 desalted 있습니다. HILIC 컬럼은 우선적으로 잘 phosphoproteomics 적합합니다 친수성 ​​분자를 유지합니다. Phosphorylated 펩티드가 아닌 phosphorylated 대응보다 색층 프로필 나중에 elute하는 경향이있다. 분별화 후, phosphopeptides은 인산 농축에 대해 요금을 부과 기반의 동질성에 의존 고정화 금속 크로마 토그래피를 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 이 절차의 뒷부분에있는 샘플은 양적 질량 분광법으로 분석 준비가 된 것입니다.

프로토콜

세포 성장 및 미디어

  1. 최소한의 효모 매체의 두 1리터 문화 (질산 황산이나 아미노산없이 0.17 %의 효모 질소베이스, 0.5 % 질산 황산)에 1.0 다음의 씨앗 OD 600-100 ML 리치 미디어에서 밤새 BY4742Δarg4Δlys1 세포의 단일 콜로니를 포함 (; Isotec 13 C 6 15 N 4)과 라이신 (13 C 6 15 N 2; Isotec) 20mg / isotopically 정상 또는 무거운 아르기닌의 L과 보충 아미노산의 완전한 보완합니다.
  2. 세포는 1.8 OD 600, 18 시간 동안 성장했다. 이것은 세포가 표시된 동위 원소의 전체 결합을 달성하기 위해 최소한 9 세대를 통과 것이 중요합니다. 가벼운 예제 매체 (isotopically 정상 아르기닌과 리신, 0.2 % Oleate (시그마 화학)와 0.5 % 트윈 40 (시그마 화학))가 포함된 oleate에 reseeded 다른 85분에 대한 자극, 멸균 물을 씻어, pelleted했다. 이것은 아르기닌과 리신과 관련하여, isotopically 빛 수율, 샘플 및 isotopically 무거운 포도당 - 재배 참조 샘플을 oleate 자극.

세포 용해, 분리 및 펩티드의 분류

  1. 원심 분리기 병의 무게를. 3 분 원심 분리하여 수확 샘플. 미디어를 제거하고 여분의 액체를 대기음. 펠렛 및 병 (일반적으로 1~2그램 간의 수율됩니다) 액화 질소에 다음 플래시 동결 나가는거야. 액체 질소 (인산 10% 글리세롤, 프로 테아제 억제제가 (SigmaFAST 프로 테아제 억제제의 알약, 시그마 (PBS, Gibco) 살린 버퍼)의 냉동 알약의 '그라인딩'버퍼의 펠렛 중량에 볼륨 상당을 추가하고 (써모 과학 인산 가수 분해 효소 억제제를 중단 )).
  2. 액체 질소의 분쇄 용기를 고정. 액체 질소가 끓는 중단 때까지 기다리십시오. 냉동 볼 베어링과 함께 분쇄 용기에 펠렛을 전송합니다.
  3. 3 분 방향 반전과 함께 1 분 20 초주기와 600 rpm으로 분쇄. 액체 질소의 연삭 함선을 Refreeze. 십오분 총 분쇄 시간을 4 번 더 반복합니다.
  4. 50ml 팰컨 튜브 장소 드라이 아이스로 냉동 grindate를 수집합니다. 사용하기 -80에서 보관 ° C까지 준비.
  5. 8M의 요소, 0.1M의 탄산수 소 암모늄, 0.1M 트리스 산도 8.6의 10ml 솔루션을 확인하십시오. 냉동 grindate 1 볼륨 (우레아 버퍼의 예제 3mls을위한 PBS 버퍼 1 ML과 1g 펠렛에 추가)에 요소 버퍼 3 볼륨을 추가합니다. 즉시 프로브 팁 sonicator (- 10초 펄스 2)와 혼합 sonicate. 솔루션의 거품 방지하기 위해 튜브의 아래쪽 끝 보관하십시오. grindate은 즉시 솔루션으로 가야한다.
  6. 4 5 분 원심 분리하여 lysate을 해제 ° C.
  7. 신선한 튜브에 뜨는 전송합니다.
  8. 0.5M 트리스의 신선한 나누어지는 만들기 [2 - carboxyethyl] phosphine (TCEP). 5mM 최종 농도에 대한 1:100에서 샘플을 추가합니다. 37 품어 ° C를 한 H.위한
  9. 감소 cysteine​​s의 알킬화. 실온으로 냉각하도록 허용합니다. 1M iodoacetamide의 신선한 나누어지는하십시오. (우리는 호일에 튜브를 줄 바꿈) 어둠 속에 보관. 20mM의​​ 최종 농도에 추가합니다. 실온에서 1 H에 대한 어둠 속에 품어.
  10. 1 H. 위해 실온에서 1M 주식에서 20mM DTT와 iodoacetamide을 끄다
  11. 표준 브래드 또는 BCA 분석 (설명하지 않음)로 단백질을 정량. 아래 SDS 페이지로 분석을 위해 샘플을 가져가라.
  12. 무거운 동위 원소의 결합을 확인하려면, 감소 및 alkylated lysate 100 μl를 사용합니다. DH 2 O와 1시 4분을 희석, sonicate 및 트립신에 50:1 단백질의 트립신을 추가합니다. C18 Ultramicrospin 열 (네스트 그룹)과 VAC 후 탈염하다 속도 다운 4 시간 최소 건조 시료에 대한 다이제스트.
    1. Acetonitrile 100 μl와 수화물 칼럼
    2. 200 μl 0.1 % TFA와 평형.
    3. 200 μl 0.1 % TFA의 건조 표본을 Resuspend. 칼럼에로드합니다. ~ 200 XG 또는 열의를 통해 흐름에 필요한 최소한의 속도로 원심 분리기.
    4. 200 μl 0.1 % TFA로 두 번 씻으십시오.
    5. 50 μl 60 % Acetonitrile, 0.1 % TFA로 두 번과 Elute.
    6. VAC 속도 건조 샘플.
    7. 20 μl 0.1 %의 개미의 산이 Resuspend 샘플. 질량 분석계 2 μl를 실행합니다. isotopically 무거운 아르기닌과 각 M / Z 스펙트럼에서 10 8 돌턴 변화에 의해 라이신의 법인을 확인합니다. 98% - 각 아미노산에 대한 설립 96 사이 여야합니다.
  13. isotopically 무겁고 가벼운 샘플 이에 상응하는 금액을 (단백질의 MG) 섞는다.
  14. 20 % 메탄올로 샘플 1시 4분을 희석.
  15. 1:200에​​서 트립신을 추가합니다. 37 밤새 품어 ° C.
  16. 그 소화는 SDS 페이지로 완료 갔어 확인하십시오. 2 4 predigestion 샘플의 μl 8를 실행게시물 트립신 다이제스트의 D 16 μl. 소화가 완료되는 쿠매시의 얼룩으로 시각화. 그것이 완료되지 않은 경우, 프로브 팁 sonicator의 잠시와 샘플을 sonicate하고 트립신로 다시 소화.
  17. VAC 속도 샘플을 건조시킵니다. 건조 펠렛이 솔루션에 들어가기까지 필터링 DH 2 O와 와동 200 μl을 추가하면. VAC 속도 아래로 드라이 샘플. DH 2 O.로 다시 Resuspend 다시 샘플을 건조시킵니다.
  18. 0.1 % Trifluoracetic 산이 Resuspend 펠릿 (TFA, 시그마). 산도가 산도 스트립을 사용하여 3시 경이되었는지 확인합니다. 10 % TFA와 시게하다 필요하면.
  19. 어떤 침전물 밖으로 펠렛.
  20. 워터스 9 월 박 VAC 500 MG C18 컬럼에서 샘플을 탈염하다. 이러한 열 과부하하지 마십시오. 최대 금액은 5 MG이지만 그것은 덜로드하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 여러 열 사이의 샘플을 나눕니다.
    1. 5 ML 100 % acetonitrile와 하이드 열. ~ 200 XG 또는 열의를 통해 흐름에 필요한 최소한의 속도로 원심 분리기.
    2. 5ml 0.1 % TFA와 열 평형. 샘플을로드합니다. 흐름을 수집하고 다시로드합니다.
    3. 5 ML 0.1 % TFA로 씻으십시오. 반복합니다.
    4. 2ml 60 % Acetonitrile, 0.1 % TFA로 Elute.
    5. VAC 속도 아래로 드라이 샘플.

Phosphopeptides의 펩타이드 분류 및 절연

  1. 펩티드는 HILIC 컬럼에 fractionated 있습니다. 우리는 TOSOH 쯧 - 젤 아미드 - 80 4.6 mm X 25cm 경비원 컬럼 분석 컬럼.를 사용하여 이 단계를 사용하여 시간을 가지고, 다음 실행을 두 개의 빈 그라디언트는 샘플을 로딩하기 전에 90%에서 2 시간 동안 컬럼을 실행합니다. 이 크기는 XX 주변에있을 것으로 생각되는 열을 최대 부하, 우리는 일반적으로 실행 당 5 개 이상 MG를 로드할 수 없습니다.
  2. 솔벤트 - 98% ACN/0.1 % TFA
    솔벤트 B - 2퍼센트 ACN/0.1 % TFA
    90%의 하중 20 ', 90 % A 85%에 이상 5', 85 % A 60 % 40 ', 60 % 0 % 5 이상', 0 % A 90 % 이상 5 '를 보자.
  3. 유속은 1ml/min이며 분수는 85% 60 % 기울기 시작하여 2 분 간격으로 수집되었다.
  4. 10 분수의 수를 줄이기 위해 분수를 결합합니다. 증가 분수는 가능성 phosphoproteome의 큰 혜택을 얻을 것입니다.

phosphopeptides의 농축

  1. Phosphopeptides는 PHOS의 선택 철 선호도 젤을 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 우리는 나누어지는 반복 동결 융해가되지 않도록하기 위해 아이맥 수지. 250 MM 초산, 30 % ACN 부하 솔루션 50 MLS하십시오. HCL로 산도 2.7 가져와. 부하 솔루션 500 μl의 알약을 Resuspend. 필요에 따라 HCL 또는 NaOH로 조정, 산도를 확인합니다.
  2. 해당 항목에 아이맥 구슬 Prewash 200 μl. 우리는 Molbiotec 스핀 컬럼을 사용합니다.
    각 분획에 50 % 슬러리 (솔루션을 로드할 젤) 15 μl를 추가하고, 최종 회전을 통해 최종 30에 대한 샘플을 '품다. 분석을위한 흐름 유지.
  3. 부하 솔루션 샘플 3 번 씻고 번 500 μl 필터 DH 2 O.
  4. 2 Elute 펩티드 - 50 MM 나 2 HPO 4 (산도 8.4) 버퍼 400 μl로 3 분. 유리관에 전송.
  5. 5 μl 100 % 개미의 산, 액체 질소에 플래시 동결하고, VAC 속도 건조 샘플 아래와 산도 3 시어지다.
  6. 0.1 % TFA하고 위에 설명된대로 깨끗한 C18 200 μl에 Resuspend phosphopeptides. VAC 속도 eluted 샘플을 건조시킵니다.
  7. 0.1 % 개미 산성 20 μl의 펩티드를 Resuspend. 이 질량 분석계 분석 μl 당 또는 필요에 따라 사용하십시오.

노트

많이 본 프로토콜의 여러분은 '장님'을 작동됩니다. 세포 용해는 서양의 모래 바닥과 브래드 또는 BCA assays, 그리고 트립신의 소화도 쉽게 평가 수에 의해 모니터할 수 있습니다. HILIC 컬럼이 하나와 유사한 추적을 준, 또는 다른 사람 [1, 2] 사용되는 액체 크로마 토그래피 시스템에 따라가 볼 것이다. 샘플은 대량 분석법에 의해 모니터링되며 이러한 높은 질량 정확도, 높은 해상도 머신에 높은 비용 분석 가기 전에 LCQs 또는 MALDIs로 저렴 컴퓨터에 샘플을 테스트합니다. 당신이 거기에 산이있는 샘플을 다운 건조 마지막 경우, 유리를 사용합니다.

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토론

이 방법은 양적 분석 수 phosphopeptides의 농축을 얻을 것입니다. 매개 변수의 숫자는이 프로토콜의 변경,하지만 기억에 가장 중요한 부분은 인산화를 보존하는 것입니다 수 있습니다. 당신이 그토록 ICAT와 같은 생체내, 태그에 전지를 라벨 수없는 경우 부량에 대한 세포의 준비는 예를 들어, 다른 여러 가지 방법으로 얻을 수 [3] 또는 ITRAC [4] differentially 부량 두 문화를 라벨에 게시물을 추출을 사용할 수 있습니다 목적.

분류에 대한 가장 일반적인 방법은 SDS PAGE [5, 6]에 의해 겔 분별화, SCX 크로마 토그래피 [7], 그리고 HILIC 크로마 토그래피 기초 [1, 2]. 아르 그것이 오히려 SCX하지만 다른 그룹은 다른 방법으로 좋은 성공을 이뤄 냈습니다 같이 그라디언트 앞에 eluting, 그라데이션이 끝날 때까지 펩티드​​를 유지하기 때문에 우리는 HILIC 선택했습니다.

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감사의 글

우리는 질량 분석계 분석과 도움이 토론과 기술 지원 박사 서식 로저스 감사하고, DRS 것입니다. 롭 모리츠, 제프 Ranish, 그리고 도움이 토론에 대한 하미드 Mirzai.

이 작품은 우수의 NIH 센터 추진하는 사업.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4Sigma-Aldrich608033
Isotec™ L-Lysine-15N2Sigma-Aldrich609021
GIBCO™ 인산염 완충 식염수(PBS) 7.4 (10X) 액상Invitrogen70011044
SigmaFAST 프로테아제 억제제 정제Sigma-AldrichS8820
Pierce Halt 포스파타아제 억제제 칵테일Thermo Fisher Scientific, Inc.78420
Retsch PM100 볼 밀 그라인더Retsch20.540.0001
Retsch 125 ml 스테인리스 스틸 그라인딩 자Retsch01.462.0148
Ultramicrospin C18 컬럼The Nest GroupSUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18WatersWAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm 분석용 컬럼Tosoh Corp.13071HILIC 크로마토그래피 컬럼입니다.
가드 컬럼 4.6 mm ID x1 cmTosoh Corp.19021HILIC 컬럼의 수명을 연장하기 위해 이 가드 컬럼을 사용할 것을 권장합니다.
PHOS-Select™ 철 친화성 겔Sigma-AldrichP9740IMAC 레진입니다. 소분하여 보관하십시오.

참고문헌

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
  6. Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

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