단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

요약

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

초록

살아있는 세포의 메커니즘에 전체 통찰력은 세포 수준에서 사건을 이끌어하고 직접 핵심 프로세스를 조사하여 얻을 수 있습니다. 생물 학적 시스템의 전단 복잡 날짜하려면 대신 상대적으로 원유 대량 앙상블 평균 측정을 사용하여 단일 시스템 연구에 초점을 맞추고, 너무 요구하는 정확한 단일 분자 실험가 발생했습니다. 그러나 많은 중요한 과정은 단지 하나의 수준에서 살아있는 세포 또는 몇 분자에서 발생, 앙상블 측정은 일반적으로이 사건의 확률과 이기종 자연을 마스크. 여기, 고급 광학 현미경 및 분석 영상 분석 도구를 사용하여 우리는 하나의 살아있는 세균 단일 분자의 정밀도로 휴대 방법과 우리가 생물 학적 기계 작동에 분자 단지 내의 역학 관계를 볼 수 있습니다 내에서 단백질을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 기술은 생리학 직접 관련이있다. 그들은 최소한 - 섭동의 공부에서 생물 학적 샘플을 비침습이며, 완전히 살아있는 재료에 수사 숙련 있으​​며, 생물 물리학의 다른 단일 분자 접근법에 즉시 사용할 수 없습니다 있습니다. 또한, 생물 학적 표본은 모든으로 자연스럽게 발생하는 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 생성하기위한보다 일반적인지만 그다지 좋지 접근 방식에 반대하는 수정되지 않은 세포 변종 ( "게놈 인코딩") 거의 동일 수준의 찬란 - 태그 단백질 생산을 공부 ( '플라스미드 표현'). 따라서, 조사하게 될 실제 생물 학적 샘플이 자연의 생물에 매우 가까이 있으며, 실제 생리 프로세스에 따라서 관측 관련성이.

프로토콜

1. 이 절차를 시작하려면, 대장균에게 박테리아 세포를 표현 형광 단백질의 냉동 주식의 50 μl가 처음 사인을 알아낼 수 없을 아침에 C. 37도에서 하룻밤 다섯 ML의 LB 성장 매체 잡고 aerobically 재배,이 포화 문화의 50 μl가 추출됩니다 , 4 일에서 6 시간 동안 30도 각도의 C에서 최소 잠복기 M63 포도당 문화 미디어로 하위 교양. 여기서 우리는 전자 - 수송을 표현 한 중 서로 다른 두 가지 세포 변종을 사용하여 보여주 GFP, GFP에 융합 박테리아 flagellar 모터에 관련된 단백질을 표현하는 다른 융합 시토크롬.
2. 세포 고정화 샘플로를 보는 경우도 증가하고 하위 문화에서 직접 수확하거나 그들이 "곁에"조건 하에서 볼 경우 박테리아 flagella을 잘라야 빠졌어 수 있습니다.
3. 전단은 멸균 배관으로 가입이 무균 주사기로 구성된 장치로 하위 문화의 일반적으로 1 - 5ml 배치 포함됩니다. 전단은 좁은 튜브를 통해 문화를 밀어 각 주사기 펌프에서 추진하고 교류에 의해 이루어집니다. 이것은 필요한 전단의 범위에 따라 50 ~ 100 배 한 것입니다. 문화 다음 flagella 조각을 제거하는 최소한의 미디어 resuspended입니다 펠릿 세포에 centrifuged 있습니다.
4. 우리는 그때 그때 드 이온화 물과 에탄올에 철....

토론

케어는이 이후 닿는 박테리아보고에 대해 "이상의 전단"세포가 flagellar 모터의 기능을 손상 수하지 않도록해야합니다. 그들은 산소가 고갈 될 수 있으므로 현미경 슬라이드에 한 시간보다 훨씬 오래 세포를 사용하는 것이 중요합니다. 상당한 최적화가 가장 현미경 이미징 조건 조사중인 특정 생물 학적 시스템에 음식을 제공 했었죠 찾을 수 필요할 수 있습니다. 그것은 특정 현미경 시스템에 필요한 정확한 강도 레이저 여기를 확인 혼자 정화 GFP를 사용하여 영상을 시도하는 것이 현명 수 있습니다.

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