이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.
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방법 논문
인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래
이 논문에서
요약
초록
탯줄은 mesenchymal stromal 세포 (또한 칭했다 mesenchymal 줄기 세포, MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)를 포함하여 높은 proliferative 가능성 전구 세포에 대한 풍부한 소스입니다. 두 세포 유형은 조직의 무결성을 유지하는 핵심 선수이며, 아마도 이것도 재생 프로세스와 종양 형성에 관여하고 있습니다.
비교 방식으로 자신의 생물학과 기능을 연구하기 위해이 같은 기증자에서 사용할 수 두 세포 유형을 가지고하는 것이 중요합니다. 또한 같은 조직에서 MSCS와 ECFCs를 추출 재생 목적을 위해 도움이 될 수 있습니다.
세포 치료제 결국 벤치에서 병상 그들의 방법을 발견해야하기 때문에 우리가 분리하는 새로운 방법을 설립하여 추가로 동물 단백질을 사용하지 않고 전구 세포를 확장합니다. 풀링 인간의 혈소판의 lysate (pHPL)는 완전히 xenogeneic 단백질로 세포의 접촉을 방지하기 위해 프로토콜의 모든 단계에서 태아 소 혈청을 대체.
이 동영상은 하나의 탯줄에서 전구 세포의 분리 및 확장을위한 방법을 보여줍니다.
모든 자료와 절차가 설명됩니다.
프로토콜
1 부 : 설정
1. 세포 배양 매체의 준비
매체 준비를 시작하기 전에 모든 자료 및 필요한 도구를 수집합니다.
해동이 풀링 인간의 혈소판 lysate의 X 56 ML aliquots (pHPL, 자수 성 가한 : 참조 1 & 조브 # 1523), 100x 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션, 2의 10 ML L - 글루타민의 X 5 ML (시그마 모두).
EGM - 2 중간 (Lonza) 1 병 (500 ML)를 보완을위한 조정 시토킨과 성장 인자의 aliquots을 (VEGF, bFGF, EGF, IGF 하이드로코티손, Amphotericin는 '단일 quots'로 제공 아스코르비 산, 헤파린) 해동.
냉장고 한 500 ML 병 각 (I) 최소한의 필수적인 매체 알파 - 수정 (A - 멤)과 (ii) 본 내피 기초 매체 (EBM)을 가져가라.
다음 단계의 모든 무균 조건 하에서 층류 조직 문화 후드에서 수행됩니다.
멸균 물 1,000 IU / ML의 최종 농도에 ....
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토론
골수, 지방 조직, 코드 혈액 등 MSCS 또는 ECFCs를 얻을 수있는 소스에서 다양한있다
그것은 동일한 소스에서 progenitors 두 가지 유형의 직접 조직과 혈관 재생 또는 종양 진행에 기여와 같은 프로세스에서 다른 세포 유형의 개입을 비교 얻을 필요합니다.
분리하고 이후 같은 기증자로부터 ECFCs 및 MSCS의 autologous 쌍을 공부하는 데 쉽게 개별 실험 이내에 기증자의 변형을 제외한이 방법이 유리합니다.
조혈 세포와 오염 가능성이 passaging 단계를 통해 최소화하고 유동세포계측법로 확인됩니다.
제대로하면, 고립된 세포는 (i) 전구 세포의 주 기능을하고, (ii) 충분한 금액 실험 이식 가능해야하며 유동세포계측법에 의해 확인 등 (3) 순수합니다.
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공개 사항
저자는 선언에 관심의 금융 충돌이 없습니다.
감사의 글
저자는 원고에게 유용한 의견, 다니엘라 탈러 및 Margaretha 천 hwirth 기술 지원, 언어 편집을위한 모니카 패럴, UWE 랑, 마짓 Holzapfel 및 산과학학과에서 산드라 Eppich에 대한 pHPL, 에바 Rohde과 니콜 호프만를 제공 Katharina Schallmoser 감사 코드를 제공.
이 작품은 오스트리아 연구 재단 (FWF, DS 부여 N211 - 할머니), 오스트리아 연구 진흥 공사 (FFG, DS 부여 N200)와 성인 줄기 세포 연구 재단 (AR)에 의해 지원되었습니다. AR는 그라츠의 의과 대학의 박사 과정 분자 의학의 동료입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| 단일 사이토카인 칵테일 | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 플라스크 | Corning | ||
| 150 cm2 플레이트 | Corning | ||
| 셀 스크레이퍼 | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| 단클론 항체 | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml 튜브 | Falcon BD | ||
| 500 mL 필터, 20 μm 공극 크기 | EMD Millipore | ||
| 보존제 미함유 헤파린 | Biochrom AG |
참고문헌
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Hu....
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재인쇄 및 허가
