에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

요약

우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를 설명 Drosophila 눈. 우리는 세부 눈 imaginal 디스크의 해부를위한 방법론과 방법이 기자는 절개 및 개발 안구의 특정 세포 유형의 식별에 도움을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

처음부터 놓습니다.
1. 다음 주걱을 사용하여 유리병이나 용기에서 여러 방황 셋째 instar의 유충을 제거하고 PBS에서 그들을 놓으십시오.
2. 절개가 유충에게 후부 향해 길을 3 분의 2를 파악 후 앞쪽에 끝에있는 어두운 색깔 입 후크를 잡아 다른 쌍을 사용하는 (당신이 바로 잡 경우) 왼손의 핀셋을 사용하여 시작합니다.
3. 이제 부드럽게 서로 떨어져 핀셋 두 쌍의 이동하여 분리 유충을 가져옵니다. mouthparts의 눈 / 두뇌 복잡한 붙어있는 신체의 나머지로부터 떨어질 수 있습니다.
4. 얼음 30-45분에 대한 4 % paraformaldehyde / PBS 용액에서 그들을 배치하여 immunofluorescence 수정이 시점에서 디스크 눈을 디스크를 얼룩합니다. 다음 PBST로 디스크에게 네 번 씻어하고 적절한 항체와 다음 얼룩.
5. 직접 슬라이드에 눈을 디스크를 해부하다하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 슬라이드에 PBS의 드롭을 장소와 mouthparts를 개최하여 PBS의 드롭으로 디스크를 이동합니다.
6. imaginal 조직은 반투명하고 눈 디스크 식별하기가 어렵습니다 그래서 처음엔 있습니다. 쉽게 그들 형광 기능과 해부 현미경을 사용하여 식별할 수 있도록. 사용 눈을 - RFP 기자 라인 아이 디스크는 명확하게 구면 광 엽 (叶) (그림 1) 오버레이 빨간색 형광 조직으로 볼 수 있습니다.
7. 당신이이 디스크에게 큰 대조를 제공하므로, 슬라이드 경사 각도에서 빛을 직접 광섬유 차가운 광원을 사용하는 경우. 눈 / antennal 디스크 뒷부분에있는 광학 스토킹을 통해 광 엽 (叶)과 앞쪽에에서 antennal 디스크에서 오는 스토킹을 통해 mouthparts에 붙어 있습니다.
8. 눈 디스크 핀셋 중 한 켤레를 사용하여 mouthparts을 보유 해부하다하고 애벌레 머리에서 눈을 디스크를 분리하는 다른 쌍을 사용하십시오. 다음 mouthparts에서 눈을 디스크를 구분합니다. 이들은 드러 누어에서 coverslip을 방지할 수로 마지막 슬라이드에서 mouthparts를 제거합니다.
9. 는 모든 눈 디스크 부드럽게 슬라이드를 기울하고 초과 PBS를 건조 해부했으면. 다음 Vectashield 한 방울을 추가하고 부드럽게 위에 coverslip을 넣으십시오.
10. 디스크는 이제 중 epifluorescence 또는 공촛점 현미경 (그림 2)에 의해 몇 군데 준비하고 있습니다.

대표 결과

제대로 해부하면 눈 / antennal 디스크는 두뇌와 같은 어떤 외부 조직의 명확한 슬라이드에 평평하게 누워 있습니다. 아이 디스크의 지느러미와 복부 기둥은 곡선 그래서 접어하는 경향이 있지만, 이것은 공촛점 현미경에서 Z - 시리즈를 감수하면서 프로젝션 이러한 섹션을 생략함으로써 피할 수 있습니다. 디스크 monolayer의 상피이지만 핵의 변수 위치는 디스크의 전체적인 사진을 얻을 수있는 Z - 시리즈 투영을 필요로합니다. 공촛점 현미경에서 찍은 일반 눈 - RFP의 눈 / antennal 디스크의 투영은 그림 2에 표시됩니다. 우리는 일반적으로 20x 또는 40x 렌즈를 사용하여 디스크를 통해 1 μm의 섹션을 가져가라. 눈 - RFP의 기자가 핵화된 따라서 그림 2에서 본 패턴이 RFP을 표현 세포의 핵을 나타내는 것입니다.

그림 1. 눈 - RFP 셋째 instar Drosophila의 유충에서 눈 / 두뇌 단지의 초기 절개. 눈 / antennal imaginal 디스크 (설명) mouthparts (MP)에 연결하고 두뇌의 광 엽을 (OL) 오버레이 볼 수 있습니다. 이미지가 눈에 디스크에있는 RFP의 표현을 보여주는 형광 현미경을 사용하여 해부 찍은 거죠. 앞쪽에는 왼쪽입니다. 스케일 바 : 300 μm의.

그림 2. 눈에 imaginal 디스크에있는 눈 - RFP 기자의 표현. 셋째 instar 아이 (ED) / antennal 디스크 (AD). 디스크 morphogenetic 퍼로우 (화살촉)를 보여줍니다 얼룩 혀끝의 세포 표면과 phalloidin (녹색)와 스테인드했다. RFP는 photoreceptors 1,6,7와 원추 세포에서, MF 주변 전구체 세포에 표시됩니다. 앞쪽에는 왼쪽입니다. 스케일 바 : 25 μm의.

토론

Drosophila 아이 imaginal 디스크의 해부는 간단하지만, 마스터 시간이 걸릴 수 있습니다. 중요한 단계는 눈 디스크와 멀리 떨어진 애벌레 두뇌로부터 절개의 식별됩니다. 아이 디스크의 식별은 눈 - RFP 라인이 여기에 설명된 사용하고 쉽게 구성되어 있습니다. 가능한 수정 antennal 디스크 또는 peripodial 멤브레인를 제거하거나 두뇌를 입력 홍보 axons을 시각화에 연결된 광 엽을 떠날 수 있습니다.

눈 - RFP 라인은 복제하여 pRed H - 스팅거 향상제 - 기자 벡터 ^3로 지적 P2 유전자 ² ​​번째 인트론에서 소설 눈을 특정 향상제 요소를 생성하고 유전자 변형 파리를 만드는 이것을 사용했습니다. 눈 - RFP의 기자는 푸에르 토리코의 특정 하위 집합 및 원뿔 세포 (그림 2).로 표시됩니다. 그것은 따라서 관심의 유전자가 이러한 세포 유형에 표현인지 여부를 확인하는 데 ...