우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를 설명 Drosophila 눈. 우리는 세부 눈 imaginal 디스크의 해부를위한 방법론과 방법이 기자는 절개 및 개발 안구의 특정 세포 유형의 식별에 도움을 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
프로토콜
- 처음부터 놓습니다.
- 다음 주걱을 사용하여 유리병이나 용기에서 여러 방황 셋째 instar의 유충을 제거하고 PBS에서 그들을 놓으십시오.
- 절개가 유충에게 후부 향해 길을 3 분의 2를 파악 후 앞쪽에 끝에있는 어두운 색깔 입 후크를 잡아 다른 쌍을 사용하는 (당신이 바로 잡 경우) 왼손의 핀셋을 사용하여 시작합니다.
- 이제 부드럽게 서로 떨어져 핀셋 두 쌍의 이동하여 분리 유충을 가져옵니다. mouthparts의 눈 / 두뇌 복잡한 붙어있는 신체의 나머지로부터 떨어질 수 있습니다.
- 얼음 30-45분에 대한 4 % paraformaldehyde / PBS 용액에서 그들을 배치하여 immunofluorescence 수정이 시점에서 디스크 눈을 디스크를 얼룩합니다. 다음 PBST로 디스크에게 네 번 씻어하고 적절한 항체와 다음 얼룩.
- 직접 슬라이드에 눈을 디스크를 해부하다하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 슬라이드에 PBS의 드롭을 장소와 mouthparts를 개최하여 PBS의 드롭으로 디스크를 이동합니다.
- imaginal 조직은 반투명하고 눈 디스크 식별하기가 어렵습니다 그래서 처음엔 있습니다. 쉽게 그들 형광 기능과 해부 현미경을 사용하여 식별할 수 있도록. 사용 눈을 - RFP 기자 라....
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토론
Drosophila 아이 imaginal 디스크의 해부는 간단하지만, 마스터 시간이 걸릴 수 있습니다. 중요한 단계는 눈 디스크와 멀리 떨어진 애벌레 두뇌로부터 절개의 식별됩니다. 아이 디스크의 식별은 눈 - RFP 라인이 여기에 설명된 사용하고 쉽게 구성되어 있습니다. 가능한 수정 antennal 디스크 또는 peripodial 멤브레인를 제거하거나 두뇌를 입력 홍보 axons을 시각화에 연결된 광 엽을 떠날 수 있습니다.
눈 - RFP 라인은 복제하여 pRed H - 스팅거 향상제 - 기자 벡터 3로 지적 P2 유전자 2 번째 인트론에서 소설 눈을 특정 향상제 요소를 생성하고 유전자 변형 파리를 만드는 이것을 사용했습니다. 눈 - RFP의 기자는 푸에르 토리코의 특정 하위 집합 및 원뿔 세포 (그림 2).로 표시됩니다. 그것은 따라서 관심의 유전자가 이러한 세포 유형에 표현인지 여부를 확인하는 데 .......
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감사의 글
이 작품은 킹스 칼리지 런던 왕립 학회에 의해 투자되었다.
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참고문헌
- Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).
- Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).
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재인쇄 및 허가
