방법 논문

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

DOI:

10.3791/1647

⸱

2009년 12월 29일

 ,  , 
1Division of Biology, California Institute of Technology

이 논문에서

요약

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우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 "등심"준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.

초록

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배아 발달의 단계 14 17 사이의 Drosophila의 배아는 쉽게 "등심"준비를 생성하기 위해 해부를하실 수 있습니다. 이러한 준비에서, 중추 신경 시스템은 중앙을 실행하고, 신체 벽 둘러싸인 있습니다. 여러 phenotypes는 그러한 준비를 사용하여 검사하고 있습니다. 대부분의 경우 필레는 항체 묻은 고정 전체 마운트 배아의 절개로 생성되었습니다. 이러한 "고정 해부는"그러나 일부 단점이 있습니다. 그들은 실행 시간이 소비되며,이 변이는 GFP 밸런서 염색체 이상 유지하는 주식에서 돌연변이 (GFP - 음수) 배아를 정렬하기가 어렵습니다. 2002 년부터, 우리 그룹은 고아 수용체에 대한 리간드를 식별 결핍 및 이소성 표현 화면을 실시하고 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해서는, 우리가 사는 배아 해부하고 균형잡힌 라인의 수백을 포함하는 컬렉션의 항체 염색법에 대한 능률 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 고정 절개로보다 라이브 절개로 주식의 대규모 컬렉션에 phenotypes을 검토하기 위해 상당히 더 효율적이라고 결론을 내렸다있다. 프로토콜 여기에서 설명한을 사용하여, 하나의 훈련 개인은 복합 현미경으로 각 라인 4-7 돌연변이 배아를 조사 phenotypes에 대해 하루에 10 라인까지 스크린 수 있습니다. 이렇게하면 한 줄에 최대 70 hemisegments가 40X 물 침지 렌즈 높은 배율의 점수이기 때문에 미묘한, 낮은 penetrance phenotypes를 부여 변이의 식별.

프로토콜

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소개

배아 발달의 단계 14 17 사이의 Drosophila의 배아는 쉽게 "등심"준비를 생성하기 위해 해부를하실 수 있습니다. 이러한 준비에는 중추 신경계 (CNS)는 중앙을 실행하고, 신체 벽 둘러싸인 있습니다. 창자가 제거됩니다. 준비와 사이에 개입에는 조직이 없기 때문에 항체 물들일 때, 필레는 전체 마운트 배아보다 CNS 및 신체 벽 구조 (예 : 모터 axons, 근육, 말초 감각 (PNS) 뉴런, tracheae)의 훨씬 더 시각화를 허용 coverslip, 그리고 생선 토막 시체 벽에 걸쳐 확장 구조는 하나의 초점 평면에 시각 수 있도록, 평면이기 때문에. 여러 phenotypes는 그러한 준비를 사용하여 검사하고 있습니다. 대부분의 경우, 필레은 고정, 항체 - 스테인드 전체 마운트 배아의 절개로 생성됩니다. 이러한 고정 준비는 다음 단계에 의해 생성됩니다 : 글리세롤의 클리어링 5),, 메탄올 3) vitelline 막 제거,, immunohistochemistry 또는 immunofluorescence를 사용하여 4) 항체 염색법, paraformaldehyde / 헵탄 2) 고정 1) 표백제와 chorion 제거 6) 텅스텐 바늘로 해부. 이러한 "고정 해부"을 얼룩에 대한 자세한 프로토콜....

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토론

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우리는이 비디오 데모들은 지금 즉시 Drosophila 유전 발생학의 경험을 가진 사람에 의해 실행될 수있는 자료에 대해 충분하고 자세하게 사는 배아 해부와 얼룩을위한 방법을 표시했다 바랍니다. 물론, 상당한 연습은 여전히​​ 주로 해부 자신을 위해 필요합니다. 우리의 경험에서 라이브 절개 방법을 배우는 모든 사람이 그 / 그녀가 가장 빠르게 고품질의 못하였 느니라 해부를 생성할 수 있도록 갑자기 ... 다른 해부 프로토콜을 생성합니다. 이 과정은 전체 개발에 대한 개월이 필요합니다. 그러나, 대부분의 사람들은 연습을 몇 주 후에 고품질의 해부를 생성할 수 있습니다.

우리가 검사를 위해 살고 해부의 사용을 선호하지만 고정 해부 프로토콜은 배아 단계의 넓은 범위에 적용할 수 있기 때문에, 그들은 고정 해부를 대체할 수 없습니다. 예를 들어, 모터 축삭지도 phenotypes위한 DF 키트의 분석, 우리는 filopodia를 포함한 모터 축삭 지점,의 세부 사항은.......

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감사의 글

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우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 공헌 니키 폭스 Aloisia 슈미트 감사드립니다. 이 작품은 KZ, NS28182하는 NIH RO1 부여에 의해 지원되었다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
필라멘트가 있는 붕규산 튜빙 Sutter Instrument Co.BF120-60-10
나리시게 모델 PC-10 니들 풀러나리시게 국제튜브 히터 레벨 58.9를 사용하여 당김

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  2. Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K.

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