우리는 흡입 전극을 사용하여 단일 마우스 콘에서 플래시 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막에있는 막대와 원뿔 photoreceptors 빛을 감지 책임이 있습니다. 어둠에서 바깥쪽 구간에 주기적 염기 - 게이 티드 (CNG) 채널 오픈하고 양이온이 세포 depolarizing, 멤브레인 안쪽에 걸쳐 꾸준히 흐름을 수 있습니다. 라이트 노출은 CNG 채널, 블록 안쪽 양이온 전류 흐름, 따라서 세포 hyperpolarization 결과의 폐쇄를 실행시킵니다. photoreceptors의 극성에 따라 흡입 녹음 방법은 고전적인 패치 - 클램프 기법과는 달리, 플라즈마 막을 관통 필요하지 않습니다, 1970 년대에 개발되었습니다
프로토콜
전극 만들기
- micropipette의 풀러를 사용하여 기록 전극을 만들어 현미경으로 가열 필라멘트와 전극을 폴란드어. 마우스 콘 단일 셀 흡입 녹음, 전극 팁의 내부 직경 6-7 μm의 약입니다.
- 참조 전극을 준비합니다. 증류수 1 %의 한천을 나가는거야. 온수 욕조에있는 한천 솔루션을 용융. 주사기를 사용하여 1 %의 한천과 유리 pipettes을 (L = 100mm, OD / ID = 1/0.75 ㎜) 입력합니다. 10 분 상온에서 한천을 응고.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 반쪽에 pipettes 컷.
- 4 최소 24 시간에 대한 참조 솔루션에서 참조 전극을 소크 ° C.
실험 설정
- 다크 하룻밤 검은 새장에 마우스를 적응.
- 100 ML 참조 솔루션 1 L 재관류 솔루션 (아래 참조) 준비와 솔루션을 필터링합니다.
- 0.1 % BSA 20 ML 참조 솔루션 10 MM의 혈당을 디졸브.
- 광도계를 사용하여 광학 자극기의 빛을 강도를 보정합니다.
- 거꾸로 현미경의 무대에서 기록 챔버를 탑재합니다.
- 95% O 2 / 5% CO 2와 버블 재관류 솔루션은 CO 2의 용해도를 증가 40 ° C 물 목욕에 품어. 이 솔루션은 병 36-38로 온난 세라믹 저항을 통과 기록 챔버 ° C.에 흐르는 히터가 이상적으로 현미경의 무대에서 가능한 녹화 실로 가까운 위치해야합니다.
- 1-1.5에 대해 ML / 분 유량에 대한 유량 조절기를 조정합니다.
- 참조 솔루션으로 기록 전극을 입력합니다. 전극 홀더에 전극을 삽입합니다. 전극에 거품이 없습니다 있는지 확인합니다. 앰프의 headstage에 홀더를 탑재합니다. 부분적으로 전극 홀더의 사이드 포트에 미네랄 오일로 채워진 튜브를 연결하여 내장된 흡입 장치에 홀더를 연결합니다. 관의 다른 쪽 끝을는 입으로하는 압력을 적용할 수있는, 미네랄 오일의 작은 저수지에 연결되어 있습니다.
- headstage의 다른 극에 대한 참조 전극을 연결합니다. 참조 전극을 열 부부 (TC)를 바인딩합니다. 전극과 TC 팁 가까이 함께 온도 읽기가 가능한 세포에 가까운 촬영되도록 있는지 확인합니다.
- 전극을 시각화하기 위해 적외선 조명을 켭니다. 전극은 모니터에 연결된 적외선 카메라로 볼 수 있습니다. 시야와 마이크로 조작하는 사람을 사용하여 모니터의 중심 전극 이미지.
- 기록 전극 팁을 참조 전극 팁 클로즈 (2~4밀리미터)의 위치를 조정합니다.
- 솔루션의 온도가 36-38에 대한 ° C.되도록 히터에 대한 DC 전압을 조정
- 일반적으로 900 kΩ에 대한, 기록 전극의 저항을 확인하는 인감 테스트를 실행합니다.
마우스 망막을 분리
- 희미한 붉은 불빛 아래, CO 2 경추 전위와 어두운 적응 마우스를 안락사. 약간 공막엔의 가장 지느러미 지점을 cauterizing하여 뜨거운 금속 토치의 팁을 사용하여 시선을 표시합니다. 가위를 사용하여 눈알을 명백히하다. 이후의 모든 절차는 적외선에 따라 수행됩니다.
- 적외선 조명 및 이미지 컨버터와 함께 현미경으로 눈알을 Hemisect.
- 각막과 렌즈를 제거합니다. 가능한 유리의 많은를 제거합니다.
- M - 원뿔 응답을 기록하려면, 소작 마르크에서 심사 면도날로 세안 컵 4 복부 부분을 제거합니다.
- 안료 상피 층에서 망막 껍질.
- 망막을 평평하게하고 1-2 ML 참조 솔루션 가득 페트리 접시의 바닥에 놓으십시오.
- 면도날을 사용하여 작은 얇은 조각으로 망막를 슬라이스하고 순수한 산소와 포화 빛을 꽉 상자에서 준비를 품어.
녹음
- 일시적으로 히터의 전원을 끕니다. 건조에서 약실을 방지하기 위해 우회 튜브에 재관류 흐름을 전환합니다.
- Kimwipe 조직의 조각을 사용하여 챔버의 솔루션 대부분의 드레인. 유리 피펫을 사용하여 녹음 챔버에 망막의 현탁액을 전송합니다.
- 망막 슬라이스가 정착 때까지 약 2 분 동안 기다리십시오. 다시 재관류를 전환합니다. 히터를 켭니다.
- 준비를 시각화하는 적외선 조명을 켜십시오. photoreceptor 외부 세그먼트 (예 : 그림 참조) 붙어서 챔버에 누워 망막의 일부를 검색합니다. 흡입에 의해 전극에 부드럽게 내부 세그먼트를 그립니다. 이 구성에서 여러 개의 핵 및 내부 세그먼트는 전극에 그려해야합니다. 콘 내부 세그먼트는 세포 치료 여부를 전극에 있으며 있는지 여부를 테스트하려면 밝은 플래시로 photoresponse를 기록네, 반응 속도론 및 진폭에 의해 판단.
- 전극의 내부 세그먼트를 개최 도움이되는 전극의 끝부분에 약간의 부정적인 압력을 적용하기 위해 광물 저수지를 낮춥니다.
- 기록 테스트 - 플래시 응답 밝은 강도에 희미에서 좋은 휴대폰이 발견되면. 테스트 섬광은 보정 광학 자극기 5 제공됩니다. 플래시 강도와 파장은 각각 중립 밀도 필터와 좁은 밴드 간섭 필터의 집합에 의해 제어됩니다. 시험 기간은 플래시 (20 MS) 컴퓨터 기반의 셔터에 의해 제어됩니다.
솔루션
- 마우스 재관류 솔루션 : 112.5 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 MM MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 10 MM HEPES (산도 7.4), 20 MM NaHCO 3, MM succinate 나, 0.5 MM 나 조미료, 0.02 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 10 MM 포도당.
- 마우스 기록 전극 솔루션 : 140 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 MM MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 3 MM HEPES (산도 7.4), 0.02 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산).
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토론
photoreceptor 세포에서 단일 세포 흡입 기록은 3 년 전 개발되었습니다. 이것은 세포막을 관통하지 않고 빛의 자극에 의해 유도된 횡단 막 전류 변화를 기록하는 데 있습니다. 때문에 높은 세포 - 세포 부착, 이건 수륙 양용 망막과 같은 마우스 망막에서 건강한 하나의 막대와 원뿔을 분리하기 어려운이며 그것은 낮은 비율 (3 %)과 작은 크기로 인해 각각의 원뿔을 찾을 수 어렵습니다. 내부 세그먼트 기능 (IS -)를 기록 방법은 원추형이 포함될 수 있습니다 그중 몇 가지 photoreceptors의 내부 세그먼트의 현재 기록하여이 어려움을 극복. 야생 타입 마우스에 반응은 막대와 원뿔의 조합해야합니다. 꾸준한 배경 조명은 막대의 반응을 억제하는 데 사용할 수 있습니다. 망막들이 G - 단백질 transducin 6 α - subunit 부족으로 막대가 가벼운 자극에 응답하지 수있는 -이 비디오에서는, 우리는 Tα - /를 사용합니다. 따라서 photoresponse는 원뿔에서입니다.
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감사의 글
실명과 어이 02687을 (워싱턴 대학에서 안과 & 비주얼 과학 계열) 방지하기 위해 연구에서 실명, NIH 그랜트 어이 019,312, 그리고 무제한 부여를 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 상을 지원.
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참고문헌
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- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).
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- Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation. J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).
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