머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

요약

의 시각화 생체내에 RNA 교통이 찬란 표시 RNA의 성적의 microinjection에 의해로 수행됩니다 Xenopus oocytes, 공촛점 현미경으로 따라갔다.

초록

RNA의 지방화는 세포 극성을 설립의 보존 메커니즘입니다. Vg1 mRNA는 Xenopus laevis oocytes과 공간의 Vg1 단백질의 유전자 발현을 제한하는 행위의 식물 극을 localizes. 이러한 방식으로 Vg1 배포 꽉 제어는 개발 배아에서 적절한 세균 계층 사양이 필요합니다. mRNA의 3 'UTR에서 RNA의 시퀀스 요소는 Vg1 지역화 요소 (VLE)가 필요하며 직접 전송하기에 충분합니다. 생체내에 Vg1 mRNA의 인식 및 전송을 연구하기 위해, 우리는 단순한 시각적인 판독을 통해 트랜스 팩터 감독 전송 메커니즘의 광범위한 분석을 수있는 이미징 기술을 개발했습니다.

RNA의 지방화를 시각화하기 위해, 우리는 찬란 표시 VLE의 RNA를 합성하고 개별 oocytes에 대한 본 사항이 명시를 microinject. 주입된 RNA의 전송을 허용하는 oocyte 문화 후, oocytes 사전 공촛점 현미경으로 영상을 고정하고 탈수 있습니다. mRNA의 현지화 패턴의 시각화는 RNA 수송의 전체 경로를 모니터링 및 CIS - 행동 VLE (루이스 외., 2008에 바인딩 증명서 및 횡단 행동 요소 내의 요소에 대한 RNA 수송 감독의 역할을 식별에 대한 기록을 제공합니다 Messitt 외., 2008). 우리는 추가 RNAS과 단백질 (가뇽과 마우리, 2009 Messitt 외., 2008)와 함께 공동 지방화를 통해이 기술을 확장 있고, 모터 단백질의 파괴와 cytoskeleton와 함께 (Messitt 외., 2008) 탐침을 mRNA의 지방화를 기본 메커니즘.

프로토콜

1 부 : 찬란 라벨 mRNA의 전사.

1. RNA의 현지화 요소 또는 기타 관련 시퀀스를 포함하는 플라스미드 DNA를 Linearize 및 DEPC - H ₂ O. 처리 1 μg / μl에 resuspend DNA 템플릿은 T7, SP6 또는 T3 RNA 효소에 의해 해독을위한 업스트림 발기인 사이트가 있어야합니다.
2. 멸균 1.5mL 튜브에 다음 시약을 추가합니다 :

   A. 10X TX 버퍼 (M & M 참조)	2 μl
   B. 20X 모자 / NTP 믹스 (M & M 참조)	1 μl
   C. 1 ㎜ 알렉사 플루어 546-14 - UTP (Invitrogen)	1 μl
   D. UTP, [α - 32 P] (1 μCi / μl) (퍼어킨 엘머)	1 μl
   E. DEPC - H 2 O	11 μl
   F. 0.2 M DTT	1 μl
   G. RNasin (Promega)

토론

여기 우리는 Xenopus의 oocytes에서 mRNA의 현지 시각을위한 프로토콜을 제시했습니다. 이 방법은, 찬란 표시 RNA의 성적표를 사용하면 이전에 dig​​oxigenin - 표시된 성적표와 함께 취득하고 간단하고 원위치 기반 접근법 (마우리과 멜튼, 1992, 고터오 외., 1997)보다 빠르고보다 노이즈 비율 높은 신호를했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 엔지니어 순서 변이를 RNA 빠르게 생체내 기능에 대해 테스트할 수 있습니다. 또한, 추가 알렉사 - UTP의 fluorophores을 사용하여 여러 RNA 종 같은 oocyte에서 시각하실 수 있습니다. 우리는 알렉사 플루어 488-5 - UTP 때문에 488 나노미터 파장 범위에서 autofluorescence의과 비교 Xenopus oocytes 알렉사 플루어에 546-14 - UTP이 우수한 결과를 제공 것으로 나타났습니다 있으나 두 RNAS의 듀얼 이미징은 (가뇽과 그럼에도 불구하고이 가능합니다 마우리 .......

재료

10X 텍사스 버퍼

• 60 MM MgCl ₂
• 400 MM 트리스 - HCL (산도 7.5)
• 20 MM spermidine - HCL

20x 모자 / NTP 믹스

• 10 MM CTP
• 10 MM ATP
• 9 밀리 UTP
• 이 MM GTP
• 20 MM G (PPP) G 총액 아날로그 (뉴 잉글랜드 Biolabs)

G - 50 컬럼

• 100 ML의 수화물 5g Sephadex G - 50 비즈 (시그마 알드리치) H ₂ O.을 deionized 30 분 DEPC는 - 치료. 그리고 압력솥. 실온에서 불완전한 주식을 저장합니다. 사용하기 전에, 다음 RNase 무료 솔루션을 추가합니다 :
• 0.5 ML 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
• 1 ML 1 M 트리스의 산도 8.0
• 0.5 ML 20% SDS
• 4 ° C.에 완전한 G - 50 솔루션을 저장
• 제거하고 폐기 플런저를 3 ML 주사기 (BD Biosciences)로부터 15 ML 원뿔 튜브 (코닝)에 주사기의 총구를 놓습니다. 글라스울 (동전의 절반 크기 플러그)의 소량으로 주사기를 꽂습니다.
• 구슬을 resuspend하는 소용돌이 완료 G - 50 솔루션입니다.
• 빈 열 2 ML G - 50 솔루션을 추가합니다.
• benchtop의 원심 분리기 1,000 X g에서 1 분간 돌린다.
• 각 열의 200 μl DEPC - 처리 deionized H ₂ O를 추가합니다. 스핀.
• 세 세척 총 두 번 더 씻어 반복합니다.
• 새로운 15 ML 원뿔 관에 주사기 배럴을 제거합니다.

Collagenase 솔루션

• 클로스 트리 디움 histolyticum (시그마 알드리치)에서 75 MG collagenase
• 25 ML 0.1 M KPO ₃ + (산도 7.4)

MBSH 버퍼

• 88 MM NaCl
• 1 ㎜ KCl
• 2.4 MM NaHCO ₃
• 0.82 MM MgSO ₄ 7H ₂ O X
• 0.33 MM 칼슘 (NO _{3) 2} X 4H ₂ O
• 0.41 MM CaCl ₂ X 6H ₂ O
• 10 MM HEPES (산도 7.6)

Oocyte 문화 미디엄

• 50% L15 미디어
• 15 MM HEPES (산도 7.6)
• 1 MG / ML 인슐린
• 100 MG / ML gentamicin
• 50 U / ML nystatin
• 50 U / ML 페니실린
• 50 MG / ML 스트렙토 마이신

MEMFA 솔루션

• 0.1 M의 대걸레 (산도 7.4)
• 이 MM EGTA
• 1 ㎜ MgSO ₄
• 3.7 %의 포름 알데히드

컴퓨팅 RNA 수율

• "입력"과 표준 신틸레이션 계수기를 사용하여 "통합"샘플의 노출당 비용 (CPM)를 결정합니다.
• 법인 = ( "법인") / (10 X "입력")
• 일반 정관 값은 0.03 ~ 0.10 사이의 범위와.
• 다른 polymerases에 대한 최대 산출 이론 :
  T3 T7, SP6 - 2.64 μg
• μg = (효소의 최대 수율이 사용) X (정관)의 반응 수율
• 50 NM = (μg RNA) /로 RNA를 희석 320 / (기지에서 RNA의 길이) / (5X10 ^-8)
• 반응은 일반적으로 수확량 ~ 50 NM에서 RNA의 50-100 μl.