주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.
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방법 논문
전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
전자 crystallography 중 하나 또는 또는 구조 기능 막 단백질의 질문에,뿐만 아니라 수용성 단백질을 연구 세 가지 차원 결정화 및 X - 선 crystallography와 함께 사용할 수있는 방법으로 진화했다. 전송 전자 현미경에 의해 2 차원 (2D) 결정에 대한 심사는 (EM) 최적화, 그리고 cryo - EM하여 고해상도 데이터 수집에 대한 샘플을 선택 찾는 중요한 단계입니다. 여기 우리는 잠재적으로 결정화 조건의 최적화에 대한 중요한 정보를 제공 수, 대형 및 주문뿐만 아니라, 작은 2D 배열을 모두 식별에 근본적인 단계를 설명합니다.
EM에서 서로 다른 배율과 협력함으로써, 중요한 매개 변수의 범위에있는 데이터가 얻어진다. 낮은 배율은 형태학 및 멤브레인 크기에 귀중한 자료를 제공합니다. 높은 배율에서 가능한 순서 및 2D 크리스탈 크기가 결정됩니다. 이러한 맥락에서, 그것은 CCD 카메라와 온라인 푸리에 변환이 순서와 크기 proteoliposomes을 평가하기 위해 더 높은 배율에서 사용하는 방법에 설명되어 있습니다.
막 단백질의 2D 결정이 가장 일반적으로 투석에 의해 reconstitution에 의해 성장하는 동안, 심사 기술 monolayers, 기본 차원 결정의 도움으로 제작 결정에 동일하게 적용되며, 수용성 단백질의 배열을 명령했다. 또한, 여기에서 설명한 방법 작은 단백질이 큰 단백질 우리의 예제와 격자로 식별에있는 치료의 동일한 금액을 요구에도 소규모의 2D 결정뿐만 아니라 큰 멤브레인 단백질에 대한 심사에 적용되는 더 쉽게 식별할 수있을 심사의 이전 단계에서.
프로토콜
1. 2D 결정화 재판의 그리드 준비
- 탄소 코팅 400 메쉬 구리 EM 격자는 부정적인 얼룩으로 준비하고 있습니다. Uranyl 아세테이트는 자주 사용 및 지속적인 격자의 장기 저장을 위해 사용뿐만 아니라 적합성 전에 몇 달 동안 솔루션의 저장 용량 측면에서 얼룩을 제공합니다. 반면, 같은 uranyl의 편대와 같은 다른 부정 얼룩, 우수한 얼룩을 제공하면서는, 갓 1 만들었해야합니다. 2D 결정화 실험의 심사에 사용되는 격자의 다수의 빠른 준비, 부정적인 얼룩의 수정된 버전이 사용됩니다. 샘플 2 μL의 볼륨은 탄소 대상 EM 그리드에 pipetted 60 S.위한 incubated입니다 이것은 왓먼의 찢어진 조각 # 4 필터 용지 (그림 1, 비디오)와 가장자리에서 모래 바닥을 따라, 그리고 1 % uranyl 아세테이트 2 μL를 즉시 적용되고있는 다시 30 후 격자의 가장자리에서 blotted 아르 S. 필터 종이의 찢어진 가장자리와 가장자리에있는 격자를 감동하면 proteoliposomes 제거하지 않고 액체의 최적의 제거를 보장합니다. 또한, 그리드의 가장자리에 건조가 탄소 필름의 향상된 보존을 보장합니다. 섬세한 탄소 필름의 파손은 샘플 접착을 방지하고 샘플의 부정 확한 표현이 발생할 수 있으므로주의가, 준비와 격자의 취급에 촬영해야합니다....
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토론
샘플 적절한 평가는 세포막의 충분한 숫자의 신중 평가가 필요합니다. 예를 들어, 180여 군데 proteoliposomes 밖으로 낮은 % 2로 결정 배열 샘플 2D 결정화 조건 7 빠르고 최적화에 대한 중요한 정보를했다.
단백질의 일부 가끔 침전이 발생하지만, 단백질의 침전이 발생하면, 그리드는 낮은 배율에서 검사 후 추가 검사에서 버려진 수 있습니다. 100 개 미만 NM의 비록 아주 작은 점막하지만 주문에 대한 유용한 정보를 줄 수 있으며 2D 크리스탈 크기를 증가 매개 변수는 다음과 투석 실험에서 구현할 수 있습니다.
실험실 검사 8,9의 과정으로 유망 자동화의 다양한 학위를 도입하는 과정에 있습니다. 여기에 명시된 바와 같이 아직 샘플은 여전히 2D 크리스탈 크기, 형태, 및 순서의 평가 및 지식의 단계가 필요합니다. 앞으로는 이러한 심사 단계 및 더욱 중요한 작은 결정.......
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감사의 글
우리는 우리의 방법과 관련된 경험과 관찰의 일부에 기여 귀중한 단백질 샘플을 제공하는 우리의 공동 작업자를 주셔서 감사합니다. 군터 Schmalzing은 친절이 프로젝트에 참여 FR 수있는 기회를 제공했습니다. 바바라 암브러스터, 야곱 브링크 및 Deryck 밀스가 자신의 뛰어난 도움말 및 장비에 대한 입력을위한 감사합니다. 기금은 NIH 부여 HL090630에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 탄소 필름이 코팅된 400-mesh 구리 TEM 그리드 | |||
| 포셉: 일반 및 항모세관용 | Dumont #5 및 Dumont N5AC 또는 유사 제품 | ||
| 마이크로피펫 및 피펫 팁 | |||
| Whatman #4 여과지 | |||
| 1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) | |||
| 2D 결정 스크리닝을 위한 투석 시료 | |||
| 글리세롤/수크로스 제거 투석 완충액 | 선택 사항 | ||
| JEOL-1400 투과 전자 현미경 (TEM) | Lab6 또는 텅스텐 필라멘트와 필름 및/또는 CCD 카메라(Gatan Orius SC1000 및/또는 UltraScan1000 CCD 카메라와 Gatan Digital Micrograph 소프트웨어 패키지 또는 Tietz 카메라(TVIPS))가 장착된 유사한 80 – 120kV TEM |
참고문헌
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crysta....
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재인쇄 및 허가
