의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

요약

비옥하게하는 절차 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방식.

초록

초기 개발을 척추에 maternally 상속 분자의 기여를 공부하는 것은 종종 산모 효과 돌연변이 동물을 생성하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해합니다. 또한, 이러한 Xenopus 및 zebrafish 같은 생물의 유전자 기능을 overexpress하거나 억제하는 기술의 대부분은 충분히 이러한 Wnt 신호 전달과 같은 중요한 산모 신호 경로를 대상으로 실패합니다. Xenopus에서 교양 oocytes에서 유전자 기능을 조작하고 이후에 그들을 풍부하게하는 것은 어느 정도 이러한 문제를 개량하다 수 있습니다. Oocytes 수동, 기증자의 난소 조직에서 defolliculated 원하는대로 주입이나 문화에 취급하고 성숙을 유도하기 위해 progesterone로 자극하고 있습니다. 그들은 숙주의 수란관을 통해 translocated 및 수정과 수정에 필요한 젤리 코팅을 획득한다 뭘로 다음 oocytes는 앤 호스트 여성 개구리의 뱃속에 소개합니다. 그 결과 태아는 다음 원하는 단계로 사육하고 실험 perturbations의 효과에 대한 분석하실 수 있습니다. 이 호스트 전송 방식은 초기 발달의 기본 메커니즘을 잠복에 매우 효과적 및 기타 척추 모델 생물에서 사용할 수없는 실험적인 가능성의 다양한 수 있습니다.

프로토콜

1. 난소 조직의 외과 제거

1. 실험의 크기에 따라 400-800 ML 사이, oocyte 문화 매체의 새로운 배치 (자료 OCM)를 준비합니다. 페놀 레드 진한 붉은 색상을 (5N NaOH의 6 이렇게 작은 방울) 전환까지 7.6-7.8로 산도를 조정합니다. 산도 전극이 미디어를 오염시킬 수 있으므로 별도의 튜브에있는 산도를 확인하기 위해 소량을 하거라. OCM 18 ° C에서 저장하고 일주일 이내에 사용해야합니다.
2. ~ 2L 버퍼 마취 용액 (재료)에 3-5 여성과 장소를 선택합니다. 우리의 하루 수술 이전에 먹힌 개구리를 사용하지 않도록하십시오. 개구리는 마취에게 굴복 당했던 반면, 70 % EtOH로 수술 영역을 소독하고 수술 악기를 준비합니다.
3. 250 뜨거운 구슬 살균기에서 20 초 침수로 수술 도구를 소독 ° C. 다음 악기는 한편으로되어야합니다 메스 핸들 (# 3) 및 블레이드 (# 10 11), 더몬트 포셉, 본 홍채 가위 (곡선 또는 직선), 할시 또는 올슨 - 헤거 마이크로 니들 홀더 및 봉합 여러 쌍. 이곳은 멸균 페트리 접시 또는 무균 유지하는 봉합 패키지의 안쪽에 악기를 소독. 시작하기 전에 원하는 방향으로 바늘 홀더에 바늘을 파악. 손잡이가 전환 악기 않고 봉합을 장식하는 데 사용할 수있는....

토론

성공적인 전송 수정 및 oocytes의> 50 % (그림 3)의 정상적인 절단을 초래할 것입니다. 양도 oocytes 일반적으로 사이 30~60%는 neurula 단계 과거 살아남을 것입니다. 우리는 보통 75-150 분석 여러 종류의 충분한 배아를 얻을 것입니다 실험적 그룹당 oocytes (현장에서 RT - PCR)뿐만 아니라 표현형를 시각화를 전송합니다. 실질적으로 더 oocytes을 이온 주입하면 크게 수율을 증가하지 않는 것. 또한, 그룹 당 적어도 30 oocytes는 적어도 일부 gastrulation를 통해 만들 것을 보장하기 위해 전송해야합니다. 염료 특정 상황에서 좋지 않은 영향을 미칠 수 있지만 중요한 염료는 일반적으로, 농도 및 여기서 설명하는 조건 하에서 배아에 영향을주지 않습니다. 고전, 뉴트럴 레드는 강한 텅스텐 기반의 광원에 노출되면 phototoxic 속성을 가지고보고되었습니다. 최근 미러 및 Heasman (2008)는 배아가 낮은 온도에서 incubated하는 경우 비즈 마크 브라운 일부.......

재료

솔루션 및 조리법 :

OCM (Oocyte 문화 매체, 와일리 외에서 수정, 1996.)

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70% Leibovitz의 L - 15 중간 (L - 글루타민을 포함)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA, 분획 V)	(시그마 A - 9천4백18~50그램)
1X 페니실린 - 스트렙토 마이신	(시그마 P - 0781)
5N NaOH로 pH를 7.6-7.8로 조정
18 ° C.에서 신선한 주간 저장하십시오

10X MMR (마크의 수정 링어의 솔루션,. 적 외, 1998)

1M NaCl
20 MM KCl
20 MM CaCl 2
10 MM MgCl 2
150 MM HEPES
산도 7.6-7.8로 조정
4 스토어 ° C

마취 용액

1g / L 3 아미노 벤 산성 에틸 에스터 (MS222)	(시그마 A - 5040)
0.7 g / L 나트륨 중탄산염
Amquel - 처리된 물에 용해
신선한 매주 확인

Progesterone 주식

100 % 에탄올 10 MM의 Progesterone (시그마 P - 0130)
500x 주식 100 % EtOH 1 mm까지 희석 / 작업 솔루션
-20 ° C에서 보관

바이탈 염료 (Heasman 외., 1991에서 수정)

블루 : 0.1 % 나일 블루	(알드리치 121479 - 5G)
빨간색 : 0.25 % 뉴트럴 레드	(시그마 N - 6634)
브라운 : 1 % 비스마르크 브라운	(시그마 B - 2759)
그린 (80 μl 블루 + 80 μl 갈색)
모브 (80 μl 블루 + 80 μl 빨간색).
여섯째 색상, 오렌지가 (80 μl 레드 + 80 μl 갈색)도 사용할 수 있지만 갈색에서 구별하는 것이 어렵다 수 있습니다.

블루, 레드와 브라운의 주식은 50 ML 튜브에 탈이온수에서 만든 락을 함께 20 분 동안 incubated 및 임상 원심 분리기에 걸려든 있습니다. supernatants는 microfuge 튜브로 aliquotted 및 -20 ° C.에 저장됩니다