의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

요약

비옥하게하는 절차 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방식.

초록

초기 개발을 척추에 maternally 상속 분자의 기여를 공부하는 것은 종종 산모 효과 돌연변이 동물을 생성하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해합니다. 또한, 이러한 Xenopus 및 zebrafish 같은 생물의 유전자 기능을 overexpress하거나 억제하는 기술의 대부분은 충분히 이러한 Wnt 신호 전달과 같은 중요한 산모 신호 경로를 대상으로 실패합니다. Xenopus에서 교양 oocytes에서 유전자 기능을 조작하고 이후에 그들을 풍부하게하는 것은 어느 정도 이러한 문제를 개량하다 수 있습니다. Oocytes 수동, 기증자의 난소 조직에서 defolliculated 원하는대로 주입이나 문화에 취급하고 성숙을 유도하기 위해 progesterone로 자극하고 있습니다. 그들은 숙주의 수란관을 통해 translocated 및 수정과 수정에 필요한 젤리 코팅을 획득한다 뭘로 다음 oocytes는 앤 호스트 여성 개구리의 뱃속에 소개합니다. 그 결과 태아는 다음 원하는 단계로 사육하고 실험 perturbations의 효과에 대한 분석하실 수 있습니다. 이 호스트 전송 방식은 초기 발달의 기본 메커니즘을 잠복에 매우 효과적 및 기타 척추 모델 생물에서 사용할 수없는 실험적인 가능성의 다양한 수 있습니다.

프로토콜

1. 난소 조직의 외과 제거

1. 실험의 크기에 따라 400-800 ML 사이, oocyte 문화 매체의 새로운 배치 (자료 OCM)를 준비합니다. 페놀 레드 진한 붉은 색상을 (5N NaOH의 6 이렇게 작은 방울) 전환까지 7.6-7.8로 산도를 조정합니다. 산도 전극이 미디어를 오염시킬 수 있으므로 별도의 튜브에있는 산도를 확인하기 위해 소량을 하거라. OCM 18 ° C에서 저장하고 일주일 이내에 사용해야합니다.
2. ~ 2L 버퍼 마취 용액 (재료)에 3-5 여성과 장소를 선택합니다. 우리의 하루 수술 이전에 먹힌 개구리를 사용하지 않도록하십시오. 개구리는 마취에게 굴복 당했던 반면, 70 % EtOH로 수술 영역을 소독하고 수술 악기를 준비합니다.
3. 250 뜨거운 구슬 살균기에서 20 초 침수로 수술 도구를 소독 ° C. 다음 악기는 한편으로되어야합니다 메스 핸들 (# 3) 및 블레이드 (# 10 11), 더몬트 포셉, 본 홍채 가위 (곡선 또는 직선), 할시 또는 올슨 - 헤거 마이크로 니들 홀더 및 봉합 여러 쌍. 이곳은 멸균 페트리 접시 또는 무균 유지하는 봉합 패키지의 안쪽에 악기를 소독. 시작하기 전에 원하는 방향으로 바늘 홀더에 바늘을 파악. 손잡이가 전환 악기 않고 봉합을 장식하는 데 사용할 수있는 가위 블레이드를 포함하고 이후 우리는 올센 -​​ 헤거 바늘 홀더를 선호합니다.
4. 십분 후에 마취 수술 비행기가 달성되었는지 확인합니다. Anesthetized 개구리 이동 중지하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 이상 살이되고. 마취는 작업을 수행하기 위해 충분한 시간 이상 15 분, 마지막으로해야합니다. 돈 적절한 수술 복장. 이것은 개인적인 선호와 제도적 동물 보호 지침에 따라 청소 장갑 (비 라텍스), 실험 가운과 수술용 마스크를 포함할 수 있습니다.
5. 무균 기술에 대한 참고 : 개구리 피부 분비물은 무균 기술은 많은 가능한 한 다음에해야하지만, 일반적으로 수술하는 동안 오염의 발생을 줄이고 항균 펩티드가 포함되어 있습니다. 외과 커튼을 사용할 수 있지만 기관 IACUCs에서 요구되지 않을 수 있으며 많은 혜택을 제공하지 않을 수도 있습니다. 손이 악기, 봉합 재료 또는 절개 사이트의 멸균 도움말을 터치 할 사용 일반적으로 "팁 기술". 악기 (비드 살균기에서) 피부의 다음과 같은 절개를 resterilized 수 있으며, 살균 영역 배치 악기 (예 : 페트리 접시 또는 봉합 패키지 등)에 대한 benchtop에서 유지 관리해야합니다. 기관 요구 사항이 크게 다를 수 있으므로, 귀하의 기관 '지침을 따르십시오 사전 공연 수술에 대한 적절한 교육을받을 수 있습니다.
6. 마취에서 개구리와 닦아 습기가 수술에 지느러미 드러누움에서 개최를 제거합니다. 합니다. 피부는 희석 povidine의 요오드 (1시 20분) 또는 chlorhexidine (0.75 %)에 rinsing하여 세척하실 수 있습니다. 그러나, 이들은 양서류의 섬세한 피부를 손상하므로, 상업 수술 스크럽, 비누 및 70% 이소 프로필 알콜을 피하십시오.
7. 정중선에 측면 복부의 아래 부분에 피부에 절개 - 메스 또는 소규모 이리스 가위를 사용하여, 작은 (1.5 cm 1)합니다. 같은 개구리의 후속 incisions가 다른 측면에서 수행되어야 잘 서로 간격. Incisions는 어느 평행 또는 직각 정중선을 만들 수 있습니다.
8. 두 단계의 피부와 복부 근육 incisions을 만듭니다. 피부를 절단 후, 근육의 레이어와 포셉와 주변의 하얀 색 근막을 채취해서 제기 근육의 절개를합니다. 가위를 사용하여 하나의 스위프트 잘라 깨끗하게 상처 가장자리를 떠나는 뱃속을 폭로하기 위해 노력 곧장 했네요. 그냥 근막이 절단되면, 그것은 철회하고 더 어려워 suturing하겠습니다. 근육을 리프팅하는 것은 실수로 모든 내부 장기를 입힐 수있는 총알 피하기 도움이 될 것입니다. 또한, 근육층 내에 가시적인 임파선 심장이나 혈관을 통해 절단되지 않도록하십시오. 그 난소가 쉽게 빠져 나왔 수 있도록 절개의 가위로 길이를 확장합니다.
9. 절개가 만들어되면 난소 명확하게 표시해야합니다. 난소를 얻어, 집게로 파악 및 난소 조직을 외면 화하다. 조직의 궁극적인 금액은 제거하고, 몸을 벽의 수준에서 잘라냅니다입니다. 이 감염 또는 기타 합병증의 원천 수로, coelomic 캐비티로 다시 조직을 다하지 마십시오.
10. 즉시 해부 현미경으로 난소의 작은 조각을 관찰하고 그들의 품질을 테스트하기 위해 몇 가지 oocytes를 defolliculate. 그들은 회사하고 균일한 크기와 착색의해야합니다. 그들이 허용하는 경우, 난소 조직의 원하는 금액을 제거하고 절개를 봉합. 90mm 페트리 접시를 채우기 위해 충분히 일반적으로 대부분의 실험 충분합니다. oocytes가 의심 품질 경우, 개구리를 봉합하고 다른 여성과 함께 반복합니다.
11. 먼저 근육과 근막 층을 suturing하여 절개를 닫습니다. n을 삽입 뿐만 아니라 근막 층을 통과해야하고, 절개에 측면 몇 밀리미터 eedle. 단지 근육을 통해 봉합은 조직을 눈물과 떨어뜨린 수 있습니다. 절개의 반대편에 아래에서 바늘을 삽입 수 있도록 집게를 사용하십시오. 풀어 통해 모든 방법을 당겨하지 돌보는, 몸 밖에서 바늘을 다시 파악하고 꼬리 남아 몇 인치 정도까지를 통해 치료를 가져옵니다.
12. suturing의 간단한 중단 패턴으로 상처를 닫습니다. 우리는 외과 의사의 광장 노트 (리프 노트)를 만들 수있는 기본적인 악기 넥타이를 사용합니다. 루프 바늘 홀더 주변 봉합의 긴 끝, 꼬리를 파악하고 대한 루프를 통해 끌어와 조입니다. 루프 다시 이겨낼,이 시간은 당신을 멀리 바늘 홀더를 가져옵니다. 셋째 던지기는 (처음과 같은 방향으로) 추가 보안을 위해 사용할 수 있습니다. , 봉합사를 좀 잘라 짧은 꼬리를 떠나, 몇 밀리미터 떨어진 근육에서 다른 치료 해. 두 봉합 작은 봉합에 충분한되며 큰 사람 세. 피부 레이어 반복합니다. 기본 suturing 기술의 비디오 데모 YouTube에서 사용할 수 있습니다 - "계기 타이"에 대한 검색, 기본 기술이 동일한 있지만 중에서 선택할 수 있도록 몇몇이있다.
13. 탈이온수과 여성을 씻어 냉각 (18 ° C) 물이 가득 복구 양동이에 그녀를 놓으십시오. 연구실에있는 동안, 개구리는 chloramines를 제​​거하는 Amquel 취급 수돗물에 보관됩니다. 몇 분 간격은 부드럽게 물에 개구리를 들고 마취에서 회복을 나타내는 되겠죠이나 눈길 불룩한 움직임을 찾아보십시오.
14. 참고 : 암컷은 작업 번호 다음에 좋은 oocytes를 만들어 나갈 것입니다하지만 서바이벌 수술은 난소 조직을 얻기 위해 엄격하게 필요는 없습니다. 생존 수술을 수행하면 사용하는 동물의 숫자를 줄일 수 있습니다. 척추 생존 수술 방법, 수술 치료 및 모니터링과 개인에 대한 허용 수술의 숫자에 대한 동물 보호 장치의 지침을 따르도록해야합니다.

2. Culturing 및 Defolliculating Oocytes

1. 수술이 끝난 직후, 90mm 요리마다 5-6 조각을 사용하여 작은 조각 (~ 2cm ²⁾ 신선한 OCM에 저장,에 난소를 나눌. 난소의 개인 엽 (叶)은 오픈 컷 아웃 평평하고 사각형 조각으로 절단됩니다. 이러한 깨끗한 OCM에 씻어서 문화 요리에 배치됩니다. 평평화과 난소를 분리하는 것은 문화의 수명을 연장하고 defolliculation 수 있도록 할 방침이다.
2. OCM의 작은 접시에 엽로 이동하고 수동 300-500 oocytes를 defolliculate. 멸균, 불타는 광택 피펫을 사용하여 전송 oocytes. 우리는 목화 - 연결의 다양한 사용하는 것은 문화의 오염을 최소화를 위해 필수적인 것으로 나타났습니다. 18 oocytes를 저장 ° 100-150 그룹 8 ML OCM에서 C (중간 요리 (팔콘 1007)에서). 연습, 당신은 1-2 시간 정도 oocytes를 defolliculate 수 있어야합니다. 그들이 fertilizable되지 않으므로 Collagenased oocytes 호스트 전송에 적합하지 않습니다.
3. 방법을 Defolliculating. 우리는 스미스 외.에 설명되어있는 기본적인 방법을 다음과 시계 '포셉 (파인 과학 도구, 기들 더몬트 # 정 또는 #), (1991)을 사용 defolliculate. 포셉 한 켤레를 (당신의 지배적인 손에)를 사용하여 대과는 난소 (줄기)에 연결된 어디에 가까운 완전한 성장 단계 VI의 oocyte를 둘러싼 진국이 결합 조직의 계층을 파악. 포셉의 다른 쌍의와 함께, 첫 번째 쌍의에 인접한 난소를 파악. 가볍게 oocyte 전체 당겨 뿌리 계층을 열고 눈물. 부드럽게 조직 밖으로 oocyte을 괴롭혀. 성공적으로 defolliculated oocytes는 oocytes 단순히 뿌리 층을 제거하지 않고 뽑아 눈에 보이는 혈관은없는 것입니다보다 floppier 있습니다.
4. 참고 : 만날 수있는 팁을 쓰기도 모자라, 포셉의 끝부분에 아주 가벼운 압력을 유지하기 위해 필수 좋습니다. 너무 밀접하게 재밌 것은 초보자 간의 공통이며, 그대로 뿌리로 끌려나되는 oocyte집니다. defolliculating 전용 집게의 좋은 쌍을 보관하십시오. 도움말 정확하게 부합해야하며 Xenopus의 배아 (그림 1)에서 explants을 만들기위한 포셉보다 약간 blunter해야합니다.
5. progesterone 및 취소 실험 20 성숙 속도가 가난한 경우 우리는 일상적으로 성숙 시험 (상온에서 6~7시간 이후 <50 %).
6. 이 시점에서, oocytes 그러한 oligo, morpholino 또는 mRNA의 microinjection으로 조작해서 원하는대로 교양 수 있습니다. 사출 절차는 연구실마다 다를 수 있기 때문에 여기에 그 설명을하지 않습니다. Oocytes는 OCM의 주일까지 유지하지만, 고립 96 시간 이내에 전송을 위해 그들을 사용하는 것이 최선하므로 일반적으로 건강은 거부하실 수 있습니다.
7. 단 다섯 여섯 그룹 (컨트롤 포함) 중요 염료에 대한 제한 때문에, 한 여성에게 이전할 수있는 것을 명심하십시오, 그래서 따라 실험을 계획입니다.

"> 3. Oocyte의 성숙과 유망 호스트 여성의 자극

1. oligo 고갈의 구조를 수행하는 경우, ~ 24 ~ 48 시간 oligo 후 mRN​​A (일반적으로 RNA의 50-300 PG)을 주입. oligos이 시간의 저하가되고 주입된 RNA에 영향을 미치지 않습니다.
2. 전에 전송을 수행하기 위해 저녁에, 중간 접시 8 ML의 OCM (최종 progesterone 농도가 ~ 2 μm의 것입니다)에 oocytes에 progesterone 작업 솔루션을 16 μL를 (EtOH에서 1mM) 추가합니다. 18 10~12시간을 품어 ° C가 oocyte의 성숙을 허용합니다.
3. 계란 부설을 유도하기 위해 hCG의 개구리 1000 단위 3-5 암컷을 주사. 우리 실험 oocyte의 성숙과 hCG 주사는 같은 시간에 주변이 완료되면 호스트 (예 : 오후 10시 -1​​0 AM)로 사전에 주입 12 시간 정도, 일하러 것 같습니다. RT 또는 18 ° C 하룻밤에 여자를 남겨주세요.

4. 준비 및 Oocytes의 바이탈 다이 스테 이닝

1. 전송의 아침 ~ 45-60 '을 설정하고 절차를 수행할 수 있습니다. 이 시점에서, 성숙한 oocytes는 mRNA의 분해 또는 단백질 표현의 효능 이후 분석을 위해 냉동 수 있습니다. 또한, oocytes가 감염될하지 않았는지 확인하고 좋은 성숙 속도 (> 50 %)가 있다고. 감염된 oocytes이 비옥하지 않습니다. 중요한 염료를 (재료) 해동 5 분 최대 속도로 회전.
2. 15 '에 대한 락을 함께 oocyte 요리와 부화 적절한 중요한 염료 (S) 80 μL를 추가하여 색 다른 실험 그룹. 이 시간 동안 호스트 여성을 선택하고 마취를 시작합니다. 느리게 정상적으로 또는 가벼운 압박과 풍부한 계란을 생산하는 한 알을 누워있는 개구리를 선택합니다. 호스트에서 계란은 양질의해야합니다. 계란이나 으깬 계란의 문자열을 누워 있어요 암컷을 피한다.
3. 신선한 OCM의 큰 접시, 세척 및 전송하기 전에 그들을 별도로 설정 간략 소용돌이에 색깔 계란을 전송합니다.
4. 이 oocytes를 이식에 사용하기 위해 oocyte를 (~ 1.5 ㎜) 수용할 정도로 그냥 통과 구멍과 살균 파스퇴르 피펫을 준비합니다. 다이아몬드 연필로 피펫을 점수와 완전히 휴식. 가장자리가 부드러운 때까지 화재 폴란드어, 잘 복용하면 자리가 폐쇄 녹기하지 않습니다.

5. Oocyte 이식을 수행

1. 대신 난소를 제거, 조작 oocytes가 피펫으로 뱃속에 소개되고 있지만 Oocyte 이식이로 부에 설명되어있는 동일한 수술 절차를 사용합니다. 이상적으로, 양도 절차를 최대한 신속하게 수행되어야하며 절개의 크기는 가능한 한 작은 보관해야합니다.
2. 호스트 여성 Anesthesize과 같은 I. 절개 작은 수있는 부분에서 설명한대로 I.가 만들어 절개 부분에 설명한 수술 도구를 준비하지만, 전송 피펫 (그림 2A)의 구멍에 맞게 충분히 크게해야합니다.
3. oocytes을 이식하려면 파악하고 상승 근육과 근막 중 하나를 떼어 포셉와 위에 준비한 파스퇴르 피펫을 사용하여 실험 oocytes을 소개합니다. 소용돌이 oocytes의 접시 중앙에 그들을 수집하고 가능한 많은처럼 빨아. 소개되는 여분의 액체를 방지하고 절개로 피펫의 팁을 삽입하고 천천히 oocytes의 뱃속 (그림 2B)로 세류 수 있도록 oocytes는 피펫의 끝에으로 정착하도록 허용합니다. 모든 oocytes 전송 때까지 반복합니다. 당신이 suturing 시작 또는 oocytes의 절개 밖으로 유출됩니다 때까지 언제든지 근육 레이어를 공개하지 마십시오.
4. oocytes가 전송되고 나면, 포셉과 절개의 양면을 파악하고 그들을 모아, oocytes가 뱃속에 정착 있도록. 첫 번째 매듭은 (그림 2C) 묶어 때까지 근육과 근막의 위쪽으로 긴장을주의한다, 설명된대로 suturing 시작합니다. 이것은 밖으로 퇴학되는 oocytes를 유지하고 절개의 가장자리가 균일하게 치유하실 수 있습니다. 근육 / 근막 층에 다른 치료를 추가하고 다음 피부를 봉합.
5. 탈이온수과 여성을 씻어 냉각 (18 ° C) Amquel - 처리된 물이 가득한 복구 양동이에 그녀를 놓으십시오. 위와 같이 마취에서 그녀의 회복을 모니터링합니다. 그녀는 수술 후 일반적으로 달걀을 세우고 시작한다.
6. 정상적인 절차를 사용하여 남성 개구리에서 testes를 얻습니다. 필요까지 OCM 또는 L15에 testes를 저장합니다. 전송 실험을 비옥하게하는 때 우리는 신선한 testis을 선호합니다.

6. Oocytes의 복구 및 체외 수정

1. 복막 속눈썹은 뱃속의 앞쪽에있는 oviducts의 구멍에 양도 달걀을 (그리고 호스트의 정상 coelomic 계란) 드라이브 것입니다. 컬러 계란은 일반적인 압박에 의해 전송 후 2-3시간를 시작 복구할 수 있습니다. 여자가 누워 멈출 때까지 계란은 매 30 시간 정도를 얻을 수 있습니다.
2. spe에 비옥4 분간 RM 중지 (~ 4 ML 1X MMR)입니다. 홍수와 0.1x MMR를 폭 린스. 계란은 일반적으로 활성화해야하며 배입니다 클리브 ~ 1.5-2 시간에 시작합니다. 양도 계란은 약간 나중에 호스트 계란보다 클리브 자주합니다.
3. 별도의 요리에 정상 및 정렬 배아로 시스테인과 젤리 외투를 제거합니다. 이것은 실험의 필요에 따라 모든 단계에서 할 수 있습니다. 다양한 4 세포 단계 주변 색상과 늦은 blastula 단계 중 가장 어려운를 식별하는 그것은 일반적으로 쉬운. 깨끗한 0.1x MMR에서 저밀도 (중간 접시 당 <50)에서 문화 계란. 이 시점에서, 배아는 취급 일반적으로 조작하실 수 있습니다.
4. 앞으로 몇 일 동안 합병증에 대한 동물 시설 및 모니터에 개구리를 반환합니다.
5. 대체 수정 방법, 높은 소금 버퍼에 달걀 - 누워
   1. 개구리는 마취에서 회복 후 ~ 1L 높은 소금 MMR (1.2x)로 그녀를 놓으십시오. 여성에 대해 4~6시간에 대한 버퍼로 알을 낳기 위해 허용합니다. 1.2x MMR 드레인 깨끗한 그릇에 색 계란을 정렬, 나머지 계란을 짜내다, 가능한 모든 액체를 제거합니다.
   2. 0.3x MMR를 폭 씻고 계란 (10 분) 활성화할 때까지 0.3x MMR / 정자 정지 최소한의 볼륨에 거름. 위와 같이 0.1x MMR과 문화 홍수. 많은 달걀이 동일한 단계에서 또는 계란의 수동 표현은 기증자 oocytes를 손상하는 경우 필요한 경우이 옵션은 유용합니다.

토론

성공적인 전송 수정 및 oocytes의> 50 % (그림 3)의 정상적인 절단을 초래할 것입니다. 양도 oocytes 일반적으로 사이 30~60%는 neurula 단계 과거 살아남을 것입니다. 우리는 보통 75-150 분석 여러 종류의 충분한 배아를 얻을 것입니다 실험적 그룹당 oocytes (현장에서 RT - PCR)뿐만 아니라 표현형를 시각화를 전송합니다. 실질적으로 더 oocytes을 이온 주입하면 크게 수율을 증가하지 않는 것. 또한, 그룹 당 적어도 30 oocytes는 적어도 일부 gastrulation를 통해 만들 것을 보장하기 위해 전송해야합니다. 염료 특정 상황에서 좋지 않은 영향을 미칠 수 있지만 중요한 염료는 일반적으로, 농도 및 여기서 설명하는 조건 하에서 배아에 영향을주지 않습니다. 고전, 뉴트럴 레드는 강한 텅스텐 기반의 광원에 노출되면 phototoxic 속성을 가지고보고되었습니다. 최근 미러 및 Heasman (2008)는 배아가 낮은 온도에서 incubated하는 경우 비즈 마크 브라운 일부...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70% Leibovitz의 L - 15 중간 (L - 글루타민을 포함)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA, 분획 V)	(시그마 A - 9천4백18~50그램)
1X 페니실린 - 스트렙토 마이신	(시그마 P - 0781)
5N NaOH로 pH를 7.6-7.8로 조정
18 ° C.에서 신선한 주간 저장하십시오

1M NaCl

20 MM KCl

20 MM CaCl 2

10 MM MgCl 2

150 MM HEPES

산도 7.6-7.8로 조정

4 스토어 ° C

1g / L 3 아미노 벤 산성 에틸 에스터 (MS222)	(시그마 A - 5040)
0.7 g / L 나트륨 중탄산염
Amquel - 처리된 물에 용해
신선한 매주 확인

100 % 에탄올 10 MM의 Progesterone (시그마 P - 0130)

500x 주식 100 % EtOH 1 mm까지 희석 / 작업 솔루션

-20 ° C에서 보관

블루 : 0.1 % 나일 블루	(알드리치 121479 - 5G)
빨간색 : 0.25 % 뉴트럴 레드	(시그마 N - 6634)
브라운 : 1 % 비스마르크 브라운	(시그마 B - 2759)
그린 (80 μl 블루 + 80 μl 갈색)
모브 (80 μl 블루 + 80 μl 빨간색).
여섯째 색상, 오렌지가 (80 μl 레드 + 80 μl 갈색)도 사용할 수 있지만 갈색에서 구별하는 것이 어렵다 수 있습니다.