우리는 하나의 살아있는 세포 내에서 subcellular 역학을 측정하는 필터링 가보와 같은 기반으로 한 어두운 현장 현미경 방법을 보여줍니다. 이 기술은 mitochondrial 조각 같은 organelles의 구조 변경에 민감합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 흠없는 살아있는 세포 내에서 organelle의 형태 및 조직에서 발생하는 subcellular 질감을 측정할 수있는 미세한 악기를 보여줍니다. 제안 악기는 organelle의 크기와 모양 nanoscale 변화에 라벨이없는 광학 현미경의 감도를 확장 및 프로그램 세포 사망이나 휴대 전화로 organelle 역학 기본 기본적인 생물 학적 과정에 관한 구조 - 기능 관계의 연구를 가속하는 데 사용할 수 있습니다 차별화. 현미경 쉽게 기존의 현미경 플랫폼에서 구현할 수 있습니다, 따라서 과학자들은 구현하고 접근할 수있는 제안된 방법을 사용할 수 있습니다 각각의 실험실에 전파 수 있습니다.
제안된 기술은 2 차원 광 가보 필터를 통해 세포를 관찰하여 subcellular 구조를 특징 수 있습니다. 이러한 필터는 nanoscale (10의 NM의) 감도가 아닌 구형 subcellular organelles의 크기와 방향에 관한 구체적인 형태학의 특성과 감각을 조정할 수 있습니다. 탄성 산란에 의해 생성되는 반면에 따라 반면, 기술은 morphometric 측정을 추출하는 자세한 역 산란 모델이나 미에 이론에 의존하지 않습니다. 이 기술은 따라서 정확한 이론적으로 흩어 설명 쉽게 부여되지 않은가 아닌 구형 organelles 적용되며, 그들의 기능을 평가하기 위해 흠없는 살아있는 세포 내에서 얻을 수있는 특유의 morphometric 매개 변수를 제공합니다. 기술은 그것이 discretized 개체의 강도보다는 변환 객체의 필드에서 직접 운영되는 디지털 이미지 프로세싱에 비해 유리한 것입니다. 그것은 높은 이미지 샘플링 속도에 의존하지 않기 때문에 따라서 크게 높은 확대 디지털 이미지의 형광 공촛점 현미경 개별 organelle 세분화와 재건축 넘어 organelle 구조의 연구를 촉진, 빠르게 한 번에 세포의 수백 이내 형태학의 활동을 화면으로 사용할 수 있습니다 보기의 제한된 분야.
이 예제에서 우리는 방법론을 설명하기 위해 해양 diatom에서 데이터를 표시합니다. 우리는 또한 메서드가 해당 생물 학적 맥락에서 적용될 수있는 방법에 대한 아이디어를주고 살아있는 세포에서 수집한 예비 데이터를 표시합니다.
프로토콜
1. 세포 준비하기
- mitochondria의 형광 이미징을위한 Mitotracker 녹색으로 표시해야 전날 도금했다 세포.
- Mitotracker의 DMSO 녹색으로 4 ° C의 냉동고에서 이전에 만들어진, 그리고 손으로 상온에 따뜻한 100 μm의 주식 솔루션을 제거합니다. 또한 대동맥 내피 세포 보빈 (BAEC) ° C benchtop waterbath에서 37 또한 이전 준비하고 따뜻한 세포 배양 매체를 꺼내.
- Mitotracker 문화 매체가 따뜻해지되면, 귀하의 장갑 낀 손 및 70 % 에탄올 용액으로 용기의 외부 표면을 소독해야하는 후드에 이들을 배치. 형광 라벨 민감한 빛이고 신속하게 주위 방 조명에 photobleach하므로, 보닛 라이트를 켜지 마십시오.
- mitochondrial 라벨에 맞는 농도를 만드는 것은 매우 중요합니다. 너무 Mitotracker가 독성 영향을 미칠 수있는 반면 너무 조금, mitochondria 효과적으로 분류하지 않습니다. 세포와 함께 45 분 동안 incubated Mitotracker 100 NM의 농도는 잘 작동합니다. 15 ML 튜브 10 ML 문화 매체 Mitotracker 주식 100 μL를 추가하여이 농도를 준비합니다. 이것은 적어도 하나의 실험들을 사귈 수 있습....
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토론
방법은 예를 들어, 입자 크기 또는 방향을 인코딩 수있는 개체의 수율 morphometric지도 위에서 설명한. 이 구조 정보는 여러 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 :
- 이것은 특정 치료 중에 변경된 후 추가로 특정 분자와 생화 학적 assays와 함께이 지역을 분석 아르 조직 또는 셀 영역을 식별하는 초기 화면으로 사용할 수 있습니다.
- 그것은 subcellular 구조 (이 방법에 의해)의 양적 특성과 분자 활동의 동시 이해 (형광으로) 결합 세포의 multimodal 분석을 항복하기 위해 형광와 함께 사용할 수 있습니다.
- 일단 특정 구조 응답이 특정 생물 학적 과정 (예 : apoptosis)에 특정 organellar 활동과 상관이며, 방법이 구조적 응답에 영향을 미치는 다른 유전자와 실험 조건을 화면에있는 형광 레이블없이 사용할 수 있습니다.
현재까지 우리는 방법은 30 - 50nm [2]의 순서에.......
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공개 사항
방법의 일부 측면과 발명 공개, 루트 거스 대학 꼬리표 # 09-049 포함되었습니다.
감사의 글
본 연구의 마이크로 미러 장치 N. Boustany에 휘태커 재단 부여 RG - 02-0682에 의해 투자되었다. 진행중인 작품은 N. Boustany 부여 NSF - DBI - 0852857으로 후원됩니다. RM Pasternack는 부분적으로 루트 회장 대학원 원정대에 의해 지원되었다. 우리는 또한 광학 필터링 전략에 관한 유용한 논의를위한 연구와 박사 DN의 Metaxas에 사용되는 iBMK 세포 박사의 E. 화이트 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 저포도당 DMEM | |
| Liebowitz L15 배지 | Invitrogen | 페놀 레드 미포함 | |
| L-글루타민 | Invitrogen | ||
| Mitotracker Green | Invitrogen | ||
| 소 뇌 추출물 | Clonetics | ||
| 소 태아 혈청 | Gemini Bio Products | ||
| 헤파린 | Sigma-Aldrich | ||
| 스타우로스포린 | Sigma-Aldrich | ||
| 디메틸설폭사이드 | Sigma-Aldrich | ||
| 도립 현미경 | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| DMD | Texas Instruments | TI 0.7 XGA DMD 1100 | |
| CCD | Roper Scientific | Cascase 512B | 고(16비트) 다이내믹 레인지 CCD |
| CCD | Roper Scientific | Coolsnap cf |
참고문헌
- Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device. Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).
- Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N.
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재인쇄 및 허가
