의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

요약

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

초록

세포 embryogenesis 동안 자신의 위치와 속성에 광범위하게 변경합니다. 이러한 변경은 세포와 그 환경 사이의 상호 작용에 의해 규제됩니다. 다른 유전 배경의 세포 구성되어 있으며 키메라 배아는 관심의 유전자에 의해 중재 세포 세포 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 초기 발달 단계에 zebrafish의 배아 투명성은 세포 수준에서 조직과 장기의 morphogenesis 직접 시각화 수 있습니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아의 망막과 두뇌 키메라를 생성하고 기증자의 세포의 라이브 영상을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜은 이식의 바늘의 이식의 준비를 다루고 GFP - 표현 GFP - 부정적인 호스트 기증자 blastomeres를 라이브 공촛점 현미경 하에서 공여 세포 행동의 시험. 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 또한 zebrafish에서 다른 조직과 장기의 배아 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 레이블 기증자 세포에 GFP를 사용하는 장점도 설명합니다.

프로토콜

1 일. 준비

1. 물고기 십자가를 설정

저녁에 zebrafish의 pairwise 교차를 설정합니다. 원하는 시간 전에 무작위로 교배를 방지하기 위해 짝짓기 카세트에서 암컷과 수컷 물고기를 구분하는 디바이더를 사용합니다. GFP - 표현 유전자 변형 물고기 것은 기증자 blastomeres의 소스로 사용됩니다. pt104 유전자 변형 라인 (Zou 외., 2008), 여기에 사용 EF1 모터의 제어하에 ubiquitously GFP를 표현합니다. GFP의 표현이 라이브 영상으로 기증자 세포의 시각화 수 있습니다. 적합한 형광 단백질을 표현하는 다른 유전자 변형 물고기 라인은 특정 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.

2. 배아 보관을위한 쐐기 모양의 아가로 오스 웰스 준비

페트리 접시에 E3 계란 물 (웨스 터, 2007)에서 준비 녹아 1퍼센트 아가로 오스를, 하거라. 아가로 오스 솔루션 쐐기 모양의 라고나할까요을 가지고 있으며, 아가로 오스 솔루션이 완전히 응고하게 플라스틱 금형을 플로트. 자세히 곰팡이를 제거하고 E3 물과 아가로 오스 침대 젖어.

토론

이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 망막과 두뇌 개발을 분석 blastomere 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 호스트 배아의 해당 위치로 기증자 blastomeres을 출시하여 다른 조직과 기관의 발전을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 분자와 라벨링은 형광 염료 복합 Dextran (호 케인 1990)와 라벨보다 깔끔한 배경을 산출. 죽은 기증자 세포에서 Dextran의 염료의 잔해가 있으므로 영상 (카탈라노 외., 2007)와 inferring, GFP보다 훨씬 더 오래 지속되기 때문입니다. 또한, GFP - 긍정적인 기증자의 세포는 Dextran의 염료를 포함하는보다 건강 있습니다.

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재료

E3 달걀 물 :

• 5 MM NaCl
• 0.17 MM KCl
• 0.33 MM CaCl ₂
• 0.33 MM MgSO ₄
• 0.1 % 메틸렌 블루