출처: Sarasija, S. 및 Norman, KR 온전한 Caenorhabditis elegans의 산소 소비율 측정. J. Vis. 특급 (2019).
이 비디오에서는 불임 성인 예쁜꼬마선충의 발달 동기화된 개체군을 생산하는 방법을 보여줍니다. 예제 프로토콜은 살아있는 동물의 산소 소비율을 연구하기 위해 벌레를 동기화합니다.
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방법 논문
선충 동기화(Nematode Synchronization): 동일한 발달 단계에 있는 벌레 개체군을 얻는 방법
17.5K 조회수
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2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
이 프로토콜은 Sarasija and Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌
한 것입니다.1. 선충 개체군의 성장과 동기화
이 동물들은 ~ 42 시간 후에 L4 애벌레 단계에 도달합니다. 이때 백금 픽을 사용하여 L4 유충을 0.5 mg/mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)을 함유한 OP50 seeded NGM plate로 이동하여 자손을 생산하는 것을 방지합니다.
노트 실험 내에서 모든 균주가 비슷한 시간 동안 동기화되어 있는지 확인하십시오. FUdR 처리는 동물을 살균하고 OCR에 영향을 줄 수 있는 산란 및 자손 생산을 방지합니다. 이러한 멸균된 동물은 분석을 위해 다음날(1일차: ~66시간에 성체 동물)을 분석합니다. FUdR은 특정 돌연변이 벌레의 생리와 수명에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 따라서 약물을 살균에 사용할 때 이를 고려해야 합니다. 기생충은 또한 fem-1(hc17) 또는 fem-3(e2006)과 같은 여성화 돌연변이를 통해 살균할 수 있습니다. 그러나 이러한 돌연변이는 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 원하는 유전적 배경(예: N2[야생형] 및 sel-12 동물)의 L4 유충을 대장균(OP50) 잔디밭에 갓 파종한 선충 성장 배지(NGM) 플레이트(레시피는 표 1 참조)로 옮깁니다. 각 변형률에 대해 최소 2개의 100mm 또는 3개의 60mm 플레이트를 사용하십시오. 적절한 성장 온도(15-25 °C 사이)에서 3-4일 동안 또는 플레이트에 많은 수의 알과 임신한 벌레가 농축될 때까지 벌레를 배양합니다.
- 선충 100mm 플레이트당 약 6mL의 M9 버퍼(레시피는 표 1 참조)를 사용하여 플레이트에서 알과 벌레를 씻어내고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 균주에 대한 개별 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 6,180 x g에서 3분 동안 스핀다운하고 동물과 계란 펠릿만 유지하면서 M9 버퍼를 흡입합니다.
- 각 튜브에 3-4mL의 표백제 용액(레시피는 표 1 참조)을 추가하고 6분 동안 간헐적으로 와류로 회전합니다. M9 버퍼를 추가하여 각 튜브를 채우고 6,180 x g에서 1분 동안 회전하고 상층액을 흡입합니다. M9로 이 세척을 세 번 반복하고 난자 펠릿을 약 9mL의 M9 완충액이 들어 있는 새로운 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 갓 부화한 벌레를 20°C에서 16-48시간 동안 너트팅하여 동기화합니다.이 튜브를 6,180 x g에서 1.5분 동안 회전시키고 동기화된 L1 동물을 OP50(100mm 플레이트당 약 6,000-10,000마리)의 잔디밭에 갓 파종한 개별 NGM 플레이트에 놓고 20°C로 유지합니다.
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결과
표 1: NGM 플레이트, M9 버퍼 및 표백제 용액에 대한 레시피.
...| M9 버퍼(1L) | |||
| 디H2O | 1,000 밀리리터 | ||
| 염화나트륨 | 5 지 | ||
| KH2PO4 | 3 지 | ||
| 나2HPO4 | 6 지 |
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mm, 60mm 페트리 접시 | Kord-Valmark 실험기구 제품 | 2900; 2901 | |
| 15 mL 코니컬 튜브 | 코 닝 | 430791 | |
| 50 mL 코니컬 튜브 | 코 닝 | 430829 | |
| 한천 | 피셔 사이언티픽 | BP1423-2 | |
| Bacto 펩톤 | BD; 박토 | 211677 | |
| 박토 트립톤 | BD; 박토 | 211705 | |
| Bacto 효모 추출물 | BD; 박토 | 212705 | |
| 표백제 | 일반적인 | ||
| 염화칼슘 이수화물(CaCl2·2H2O) | 피셔 사이언티픽 | C79-500 | |
| 콜레스테롤 | 피셔 사이언티픽 | C314-500 | |
| 탈이온수(dH2O) | |||
| 유리 파스퇴르 피펫 | Krackeler 사이언티픽 | 6-72050-900 | |
| 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 (MgSO4·7H2O) | 피셔 사이언티픽 | BP213-1 | |
| 인산칼륨이염기성(K2HPO4) | 피셔 사이언티픽 | BP363-1 | |
| 인산칼륨 일염기성 (KH2PO4) | 피셔 사이언티픽 | P285-500 | |
| 염화나트륨 | 피셔 사이언티픽 | BP358-10 | |
| 수산화나트륨(NaOH) | 피셔 사이언티픽 | BP359-500 | |
| 인산 나트륨 이염기 무수 (Na2HPO4) | 피셔 사이언티픽 | BP332-1 |
