표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포는화물의 적극적인 세포내 수송을 지원하기 위해, 이러한 kinesin 모터 단백질 및 미세 소관의 필라멘트로 복잡한 분자 기계를 발전시켜 왔습니다. kinesins 꼬리 도메인화물의 다양한 바인딩 있지만, kinesins 머리 도메인은 미세 소관을 따라 격자 단계로 ATP 분자에 저장된 화학 에너지를 활용. 길고 뻣뻣한 microtubules는 장거리 세포내 전송을위한 트랙으로 제공하고 있습니다.
이러한 모터 및 필라멘트는 분자 셔틀 하나의 구성 요소로서 microfabricated 합성 환경에서 근무하실 수 있습니다. 자주 사용되는 디자인, kinesin 모터 자신의 꼬리를 통해 트랙 표면에 고정하고, 기능화 microtubules이 모터에 의해 추진 아르화물 운송 요소로 제공하고 있습니다. 이 셔틀은 비오틴과 streptavidin 사이의 강력하고 선택 바인딩을 이용하여화물로 로드할 수 있습니다. 주요 구성 요소 (biotinylated tubulin, streptavidin과 biotinylated화물) 상업적으로 사용할 수 있습니다.
고전 거꾸로 운동성 분석 2 빌딩 분자 셔틀 건설 여기서 자세한 내용입니다. Kinesin 모터 단백질은 카제인과 precoated 표면에 adsorbed되며 microtubules는 biotinylated tubulin에서 polymerized kinesin을 준수하고 이후 rhodamine - 라벨 streptavidin과 함께 코팅하고 있습니다. ATP 농도는화물 3 로딩을위한 최적의 미세 소관 글라이딩 속도를 달성하는 subsaturating 농도에서 관리하고 있습니다. 마지막으로, 플루오레신 - 표시 nanospheres은화물로 추가됩니다 biotinylated. Nanospheres은 표면에 준수 글라이딩 microtubules와 nanospheres 사이의 충돌의 결과로 microtubules을 첨부합니다.
프로토콜은 쉽게 이러한 biotinylated DNA 4, 양자 점 5 biotinylated 항체 4-6 통해 항원의 다양한으로화물의 다양한 로드할 수 수정할 수 있습니다.
프로토콜
1.) 버퍼 및 시약
이러한 솔루션은 사전에 준비하고 편리하게 크기 aliquots에 보관해야합니다. 나누어지는는 전형적인 실험과 신선한 나누어지는 각 운동성 분석을 위해 사용되어야에 대한 충분한 해결책을 포함해야합니다. 저장 조건 및 전형 나누어지는 크기는 다음과 같은 프로토콜에 언급하고 있습니다.
1. BRB80 버퍼 (80 MM 파이프, 1 MM MgCl 2, deionized 소주 1 MM EGTA (DD) 물, 코에서 6.9로 조정 PH)
- DD 물에 0.5 M EGTA의 100 ML 주식 솔루션을 확인하십시오. 2 M NaOH 용액을 사용하여 7.0으로 산도를 조정합니다.
- DD 물 1 M MgCl 2 100 ML 주식 솔루션을 확인하십시오. 솔루션을 압력솥.
- 파이프와 DD의 물을 약 800 ML에 3.1 g 코 알약의 24.2 g을 추가하고 디졸브로 저어. 1 M 코 솔루션을 사용하여 6.9으로 산도를 조정합니다. 0.5 M EGTA 주식 솔루션과 1 M MgCl 2 주식 솔루션 1 ML 2 ML을 추가합니다. DD 물로 볼륨 1000 ML로 가져 오십시오.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
사소한 수정이 프로토콜은 성공적으로 kinesin - 미세 소관 운동성 기반의 assays를 조립하는 그룹의 다양한 의해 사용되고 있습니다. 최종 운동성 솔루션 10 MM의 DTT는 0.5 % β - 메르 캅 토 에탄올로 대체 수 있습니다. 2 시간 이상 된 표준 솔루션 (BRB80AF, KIN20 및 MT1000) 사용해서는 안됩니다. 특히 taxol과 microtubules를 포함한 모든 솔루션은 얼음에 배치해서는 안됩니다. 기능 구성 요소 photodamage의 UV 여기 광 결과에 흐름 세포의 과도한 노출 :. 흐름 세포 이러한 폴리스티렌 nanospheres로 높은 산소 확산과 폴리머를 포함하는 경우 microtubules와 kinesin 8이 효과는 더욱 발음 9.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 그의 그룹 이후 회사에 의해 조정되었다 글라이딩 운동성 분석을위한 기본 프로토콜을 개발 조나단 하워드에 크게 빚을 수 있습니다. NSF 그랜트 DMR0645023의 재정 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| 비오틴 튜불린 (Biotin tubulin) | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| 카제인 (Casein) | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| 카탈라아제 (Catalase) | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-포도당 (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| 디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide, DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| 디티오트레이톨 (Dithiotreitol, DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres 비오틴화 미세구체, 40 nm, 황록색 형광 (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| 포도당 산화효소 (Glucose oxidase) | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| 염화 마그네슘 (Magnesium Chloride, MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| 파클리탁셀 (Paclitaxel, Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| 수산화 칼륨 (Potassium hydroxide, KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| 수산화 나트륨 (Sodium hydroxide, NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 568 접합체 | Invitrogen | S11226 |
참고문헌
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.<....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
