세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

초록

출처: Dillard, P., et al. CAR T 세포에 의한 스페로이드 사멸 분석. J. Vis. 특급 (2018).

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

프로토콜

1. 대장암 세포주에서 스페로이드 생성

1. HCT 116(CD19(Cluster of Differentiation 19) 및 GFP(Green Fluorescence Protein)를 발현하기 위해 안정적으로 형질전환됨) 세포 단층을 인산염 완충 식염수(PBS, 25cm² 플라스크의 경우 5mL 또는 75cm² 플라스크의 경우 10mL)로 세척합니다. 트립신(25cm² 플라스크의 경우 0.5mL 또는 75cm² 플라스크의 경우 1mL)을 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
2. 현미경으로 세포 박리를 확인하고 완전한 Roswell Park Memorial Institute 160 배지(RPMI 1640)(RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycin, 25cm²의 경우 10mL 또는 75cm² 플라스크의 경우 20mL)로 세포 해리 효소를 중화합니다.
3. 500 x g에서 5분 동안 원심분리 세포 현탁액 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 5mL의 완전한 RPM1 1640 배지로 여러 번 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다.
4. 호환 가능한 셀 카운터에서 Trypan blue exclusion을 사용하여 셀 수를 계산합니다.
5. 500 x g에서 5분 동안 원심분리 세포 현탁액 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 RPMI 배지에 재현탁하여 5 x 10³cells/mL를 얻습니다.
6. 실온에서 1시간 동안 PBS에 100μg/mL의 폴리-L-라이신(PLL)을 100μL/웰로 96웰 원형 바닥판을 코팅합니다. PBS로 두 번 씻고 접시를 말리십시오.
7. 셀 현탁액을 멸균 저장소로 옮기고 멀티채널 피펫을 사용하여 PLL 코팅된 96웰 원형 바닥 플레이트에 200μL/웰을 분주합니다.
8. 플레이트를 인큐베이터 내부의 자동 이미징 장치(37°C, 5% CO₂, 95% 습도)로 옮깁니다.
9. 획득 소프트웨어에 로그인하고 Schedule To Acquire(획득 일정) | Launch Add Vessel(선박 추가) | Scan On Schedule(일정에 따라 스캔) | Create Vessel: New(선박 생성: 신규)를 선택합니다.
10. 스캔 유형: 스페로이드를 선택합니다. 관심 채널을 선택합니다: 위상 + 명시야(스페로이드 성장 추적), 녹색(종양 신호 추적, 획득 시간 300ms) 및 빨간색(세포사멸 추적, 획득 시간 400ms).
    1. 원하는 배율(10배)을 선택합니다.
    2. 플레이트 모델과 서랍에서 해당 위치를 선택합니다. 이미지화할 웰의 위치를 선택합니다. 실험에 대한 설명(이름, 세포 유형, 세포 수)을 입력합니다.
11. 해석 설정의 경우 나중까지 해석 연기를 선택합니다. 타임라인을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 설정옵션을 선택하고 스캔 추가를 4시간으로 설정하고 총 24시간으로 설정합니다. 원하는 시작 시간을 설정합니다(자동 이미징 장치에서 배양 후 최소 1시간).
12. 이미징 소프트웨어에 로그인하여 2일마다 스페로이드의 성장을 확인하십시오.
    1. View Recent Scans(최근 스캔 보기) 옵션을 선택하고 원하는 실험을 두 번 클릭합니다. 이미지 채널 패널에서 명시야를 선택한 다음 이미지 특징 측정 도구를 사용하여 스페로이드의 직경을 측정합니다. 스페로이드가 원하는 크기(직경 0.5mm)에 도달하는 데 6일이 걸립니다. 배지 증발 효과를 제한하기 위해 4일차에 웰당 50μL의 완전한 RPMI 배지를 추가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	D8537-500ML	로트 번호: RNBG7037
75cm² 성장 면적 플라스크	폭스바겐	430639	로트 번호: 2218002
75cm² 성장 면적 플라스크	폭스바겐	Tel.: 734-2705	로트 번호: 3718006
트립신 -EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	로트 번호: SLBTO777
RPMI 1640 med L- 글루타민, 10 x 500 mL	생명 기술(Gibco)	21875-091	로트 번호: 1926384
겐타마이신	써모 피셔	15750060	로트 번호: 1904924A
트리판 블루 솔루션, 0.4%	써모 피셔	15250061	로트 번호: 1886513
96 웰 플레이트, 둥근 바닥	폭스바겐	734-1797	로트 번호: 33117036
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, 페놀 레드, 1 L	바이오노르디카	BE02-060Q	로트 번호: 8MB036
시약 저장소	폭스바겐	89094-672	로트 번호: 89094-672
15 mL 튜브	폭스바겐	734-1867	로트 번호: 19317044
태아 소 세럼	지브코	10500064	로트 번호: 08Q3066K
HCT 116 결장직장 암종 라인	증권 시세	CCL-247	-
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