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Abstract

출처: Koemans, T. S., et al. 학습과 기억의 척도로서의 초파리 구애 조건화. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 구애 조건화(courtship conditioning)라고 하는 초파리의 학습과 기억을 테스트하는 고전적인 조건화 분석법에 대해 설명합니다. 이 분석은 수용하지 않는 조산한 암컷에 의한 거부를 경험한 후 수컷의 구애 감소를 기반으로 합니다. 예제 프로토콜은 단기 및 장기 기억을 평가하는 데 사용할 수 있는 절차에 대한 설정을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.

참고: 아래에 설명된 프로토콜에서는 수집, 학습 및 테스트의 한 복제에 대해 설명합니다. 결과의 재현성을 테스트하기 위해 이러한 단계를 여러 날에 걸쳐 별도의 파리 그룹으로 병렬로 반복해야 합니다(표 1). 이 프로토콜은 알에서 성체까지 10일의 생애 주기를 기반으로 하며, 이는 25°C, 70% 습도 및 12시간의 명암주기의 일정한 조건에서 사육할 때 정상입니다. 이 프로토콜의 모든 측면에서는 조건이 전체 분석에서 일정하게 유지된다고 가정합니다. 시간은 인큐베이터에서 조명이 켜지기 전(BLO) 또는 조명이 켜진 후(ALO)로 표시되며, 이는 연구자가 선호하는 시간에 따라 편리하게 설정할 수 있습니다. CO₂ 가스는 순진한 수컷 파리의 초기 수집과 조산된 암컷의 수집에만 사용하십시오. 구애 조건화를 위한 이 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다.

1. premated female 컬렉션 문화의 정착
2. 남성 피험자 수집을 위한 문화 정착
3. 하우징 블록의 준비
4. 표준화된 premated 암컷 생산을 위한 교배 바이알 구축
5. 남성 피험자 집단 채취
6. 훈련
7. 테스트
8. 비디오 데이터 분석 및 통계

1. Premated Female Collection 문화의 확립

1. 파워푸드를 준비합니다. 한천 0.8%(w/v), 효모 8%(w/v), 효모 추출물 2%(w/v), 펩톤 2%(w/v), 자당 3%(w/v), 포도당 6%(w/v), MgSO₄ 0.05%(w/v) 및 CaCl₂ 0.05%(w/v)를 물에 15분 동안 끓입니다. 0.05%(w/v) 메틸파라벤(주의: 독성) 및 0.5%(v/v) 프로피온산(주의: 독성)을 첨가하기 전에 용액을 70°C로 냉각시킵니다. 50°C로 더 냉각하면서 교반하여 잘 혼합하여 균일한 용액을 얻습니다.
2. 식품이 실온에서 응고되기 전에 각 175mL 플라스틱 바이알에 ~50mL의 powerfood를 추가합니다. 음식을 더 식히십시오. 플러그로 바이알을 닫습니다.
   참고: Powerfood는 아마도 알을 낳도록 유도하여 많은 수의 파리를 생산하기 위해 특별히 제조된 특수 식품 혼합물입니다. Powerfood는 비정형 식단과 잠재적인 밀집이 발달에 영향을 미칠 수 있기 때문에 행동 분석(2단계)에 사용될 수컷 파리를 생산하는 데 사용되지 않습니다.
3. -11일째(표 1)에 파워푸드 바이알에 약 60-100마리의 파리(수컷과 암컷이 혼합됨)로 5-20개의 야생형 배양을 시작합니다. 이들은 표준화된 조산 암컷을 생산하기 위해 4단계에서 사용됩니다. 유충이 번데기가 될 수 있는 면적을 늘리기 위해 각 바이알에 여과지를 추가하십시오. 이렇게 하면 닫을 수 있는 파리의 수가 늘어납니다.
4. “표준화된 조산 암컷 생산을 위한 짝짓기 바이알 설정”(4단계)을 위한 입력으로 충분한 새로 폐쇄 파리를 얻기 위해 실험 전반에 걸쳐 주기적으로 1.1-1.3단계를 반복합니다.

2. 남성 피험자 수집을 위한 문화 확립

1. 1.1단계와 1.2단계에서 설명한 대로 물에 한천 0.5%, 효모 2.75%(w/v), 옥수수 가루 5.2%(w/v), 설탕 11%(w/v), 메틸파라벤 0.05%(w/v) 및 프로피온산 0.5%(v/v)로 만든 일반 식품을 준비합니다. 175mL 플라스틱 바이알을 플라이 바이알 플러그로 닫습니다.
2. -10일째(표 1)에 약 10-20마리의 수컷과 약 30-75마리의 처녀 암컷(재료/장비 표)을 일반 식품이 들어 있는 각 175mL 바이알에 넣습니다. 번데기의 표면적을 늘리고 생산성을 극대화하기 위해 여과지를 추가하십시오.
3. 유전자형당 3-6개의 175mL 바이알을 설정하여 필요한 수의 피험자 남성을 얻습니다.
   참고: 원하는 유전자형의 생산성에 따라 더 많은 바이알이 필요할 수 있습니다.

3. 하우징 블록의 준비 (그림 2A)

1. 하우징 블록당 약 50mL의 powerfood를 전자레인지에 녹이거나 신선하게 준비합니다.
2. 멀티디스펜서 피펫을 사용하여 바닥이 평평한 96웰 블록의 각 웰에 500μL의 파워푸드를 추가합니다.
3. 음식이 실온에서 굳어지도록 하십시오.
4. PCR 접착 필름으로 블록을 덮고 바늘을 사용하여 우물당 최소 4개의 구멍을 만들어 파리에게 신선한 공기를 제공합니다.
5. 각 우물을 열 수 있으려면 면도날을 사용하여 각 줄 사이의 접착 필름을 세로로 자릅니다. 블록의 한쪽 끝에 필름을 그대로 둡니다.
6. 블록은 4°C에서 최대 2일 동안 보관할 수 있습니다.
   참고: 사용하기 전에 블록이 실온으로 다시 평형을 이루도록 하십시오.

4. 표준화 된 조산 암컷 생산을위한 짝짓기 바이알의 설립

1. -1일차에 2-5시간 BLO에서 사전 조기 암컷 수집 배양에서 모든 성체 야생형 파리를 제거하고 폐기합니다.
2. 이 바이알에서 흡인기(그림 2B)를 사용하여 2-3시간 간격(예: 30분, 2.5시간 및 5시간 ALO)으로 파리를 수집하고 소량의 효모 페이스트와 여과지가 보충된 새 powerfood 바이알에 넣습니다.
3. 혼잡을 피하고 최적의 짝짓기 분위기를 조성하려면 각 새 바이알에 150-200마리 이상의 파리를 옮기지 마십시오. 최소 25%의 수컷을 제공하여 모든 암컷의 짝짓기를 보장합니다. 실험의 크기를 수용할 수 있을 만큼 충분한 암컷이 짝짓기 바이알에 있는지 확인합니다.
   참고: 이것은 프로토콜에서 중요한 단계이므로 갓 닫힌 파리만 있고 오래된 파리, 유충 또는 번데기가 새로운 짝짓기 바이알로 옮겨지지 않도록 하십시오.
4. 이 “짝짓기 바이알”을 4일 동안 배양하여 모든 암컷이 짝짓기를 할 수 있는 충분한 시간을 확보하십시오.

5. 남성 피험자 모음

1. 1일차(표 1)에서 2-3시간 BLO에서 CO₂를 사용하여 수컷 수집 바이알에서 모든 성충 파리를 제거하되(2단계) 다음 몇 시간 동안 더 많은 파리가 닫히도록 합니다.
2. 다음 5-6시간 동안 CO₂를 사용하여 20-30분마다 새로 폐쇄된 파리를 제거하고 흡인기(그림 2 B)를 사용하여 각 수컷을 하우징 블록(3단계)의 개별 웰에 넣습니다.
3. 접착 PCR 필름으로 웰을 다시 밀봉합니다.
   참고: 이것은 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 수컷은 자주 수집해야 합니다. 수집된 수컷은 옅은 색소 침착과 반투명 복부에 태변의 존재를 입증하는 폐쇄 시간에 가까운 하우징 블록에 격리되어야 합니다.
   참고: 흡인기의 부드러운 사용은 파리의 이동을 허용한다; 그러나 부적절하게 사용하면 파리에 스트레스를 주어 분석에 차이를 유발할 수 있습니다(토론 참조).
4. 유전자형당 최대 48마리의 수컷을 수집하는 것을 목표로 합니다. 이것은 순진한 상태와 훈련된 상태 모두의 분석에 필요한 최대 수컷 수에 약간의 초과를 제공하여 이후 전달 단계에서 약간의 손실을 허용합니다.

6. 교육

1. CO₂를 사용하여 짝짓기 바이알에서 파리를 제거하고(4.2단계) 미리 준비된 암컷을 수컷과 분리합니다.
2. 흡인기를 사용하여 마취되고 사전 촬영된 암컷 한 명을 새 하우징 블록의 한 줄에 있는 각 웰에 추가합니다.
3. 흡인기와 마취 없이 흡인기를, 5.2단계에서 설정한 하우징 블록에서 개별 순진한 남성을 조산된 암컷이 있는 우물로 옮깁니다. 수컷을 우물에 넣은 후 접착 필름으로 즉시 다시 밀봉하십시오. 수컷이 도망치지 못하게 하십시오.
   참고: 수컷 파리를 흡인기에서 주택 블록으로 이동시키는 것은 수컷의 자연스러운 “negative geotaxis” 행동을 이용합니다.
4. 충분한 수암수 쌍이 설정될 때까지 6.2-6.3단계를 반복합니다. 이상적으로는 유전자형당 24쌍, 2개의 전체 행의 하우징 블록을 설정합니다. 나머지 순진한 수컷은 5.2단계에서 설정한 원래 하우징 블록에 그대로 둡니다.
5. 훈련 기간 동안 수컷-암컷 쌍을 방해하지 마십시오(표 2, 그림 1B).
   참고: 이 기간 동안 수컷은 구애하고 미숙한 암컷에게 거부당합니다. 학습 및 STM의 경우 교육 기간은 1시간이고 LTM의 경우 교육 기간은 7-9시간입니다.
6. 흡인기> 사용하여 수컷과 미숙한 암컷을 부드럽게 분리하여 훈련을 끝내십시오(표 2, <strong class="xfig"그림 1B). 마취제를 사용하지 마십시오. 분리된 수컷을 새 하우징 블록에 배치합니다.
7. 흡인기기를 사용하여 모든 순진한 남성을 마취 없이 부드럽게 5.2단계에서 설정한 하우징 블록에서 새 하우징 블록으로 옮깁니다.
   참고: 이 단계는 STM 및 학습에 선택 사항이지만 LTM을 테스트하기 위해 파리가 추가로 24시간 동안 보관되기 때문에 LTM에 매우 중요합니다.
8. STM 및 LTM의 경우 테스트하기 전에 수컷이 각각 1시간 및 ~24시간 동안 휴식을 취하도록 합니다(표 2, 그림 1B).
9. 학습을 위해 훈련되고 순진한 수컷을 즉시 테스트하십시오 (7 단계).

7. 테스팅

1. CO₂를 사용하여 짝짓기 바이알에서 파리를 수집하고(단계 4.2) 미리 준비된 암컷을 수컷과 분리합니다.
2. 암컷이 일반 음식이 들어있는 바이알에서 최소 1시간 동안 마취에서 회복되도록 합니다.
3. 테스트를 시작하기 전에 모든 장비를 준비하기 위해 비디오 레코더를 미리 장착하십시오(그림 2C).
4. 학습, STM 및 LTM에 대한 서로 다른 타임라인에 따라 테스트를 시작합니다(표 2, 그림 1B). 학습을 위해 훈련 직후, STM에 대한 훈련 후 1시간, LTM에 대한 훈련 후 24시간 후에 테스트를 수행합니다.
5. 흡인기(aspirator)를 사용하여 학습 테스트 중인 경우(6.7단계, 훈련, 6.8단계, 순진) 휴지 하우징 블록 또는 훈련 하우징 블록에서 개별 남성을 칸막이가 닫힌 구애 경기장의 절반으로 부드럽게 이동시킵니다(그림 2D, 건축 계획은 파일 S1 참조).
   참고: 자연스러운 “negative geotaxis” 행동의 사용은 수컷 파리를 흡인기에서 구애 경기장으로 이동시키기에 충분해야 합니다.
6. 빠르지만 부드럽게 입구 구멍을 다음 투기장으로 옮기고 18개 투기장에 수컷 한 명이 모두 포함될 때까지 7.5단계를 반복합니다.
7. 흡인기와 CO₂ 없이 한 명의 premated 암컷(7.2단계에서 수집)을 18개 경기장 모두의 다른 절반에 추가합니다.
8. 우물의 입구가 아래를 향하도록 구혼실을 카메라 아래에 조심스럽게 놓습니다(그림 2C).
9. 수컷과 미숙한 암컷 사이의 직접적인 상호 작용을 허용하기 위해 경기장의 칸막이를 제거하십시오.
10. 즉시 최소 10분 동안 동작 기록을 시작합니다.
    참고: 두 대의 카메라 설정을 사용하는 경우 두 개의 구애 플레이트를 겹치는 시간대로 동시에 녹화하여 효율성을 극대화할 수 있습니다.
11. 휴대용 진공 청소기를 사용하여 구애 경기장을 비우고 재사용하기 전에 구애 챔버를 환기시키십시오.
12. 모든 유전자형 및 상태(즉, 순진하고 훈련된)의 테스트가 완료될 때까지 7.4-7.11단계를 반복합니다.

8. 비디오 데이터 분석 및 통계

1. 각 개별 수컷 비행에 대해 테스트 기간의 처음 10분 동안 수컷이 코트하는 시간의 백분율로 정의되는 구애 지수(CI)를 계산합니다.
   참고: 이것은 전형적인 구애 행동(그림 1 A)을 관찰하거나 구애 행동을 자동으로 정량화하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다.
   참고: 충분한 통계적 검정력을 달성하고 CI 데이터의 일관성을 판단하기 위해 3일 동안 조건당 40-60명의 남성을 분석하는 것이 좋습니다.
2. 나이브 남성과 비교하여 훈련된 남성의 평균 CI 감소율로 정의되는 학습 지수(LI = (CI_나이브 –_{CI 훈련)} / CI_나이브)를 계산합니다. 각 테스트 날짜에 대한 LI를 평가하고 모든 테스트 날짜에서 계산된 누적 LI와 비교합니다.
3. “Genotype” 및 “CI”를 headers.
   로 사용하여 별도의 2열 탭 데이터 파일을 만듭니다. 참고: 이러한 제목은 대소문자를 구분합니다. 각 CI의 유전자형 이름은 유전자형에 대한 설명, 밑줄 및 훈련 조건(예: genotype_N 및 genotype_LTM 등, 여기서 N = naive 및 LTM = 장기 기억, 예는 보충 파일 S2 참조)으로 구성되어야 합니다. 이 주석은 analearn 함수가 “Genotype” 열의 첫 번째 밑줄 뒤에 있는 문자를 기반으로 훈련된 파리와 순진한 파리를 식별하기 때문에 필수적입니다.
4. analearn R 스크립트(보충 파일 S3)를 사용하여 무작위 테스트를 수행하여 서로 다른 유전자형의 LI 값 간 차이에 대한 통계적 유의성을 판단합니다.
   1. 스크립트(Supplemental File S3)를 “analearn”이라는 함수를 정의하는 R에 소스화합니다.
      참고: 함수 정의는 analearn <- function(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE)입니다.
   2. R 명령줄에 “analearn()”을 입력하고 팝업 창을 통해 분석할 데이터 파일(8.3단계에서 생성됨)을 선택하여 함수를 시작합니다.
   3. 해당 번호를 입력하고 enter.
      를 눌러 대조 유전자형인 참조 돌연변이를 선택합니다. 참고: 참조 유전자형을 선택한 후 스크립트는 10,000번의 부트스트랩 복제를 수행하는 데 몇 초가 걸립니다.
   4. 유전자형, 학습 조건(즉, 학습, STM 또는 LTM), 평균 CI 나이브, 평균 CI 훈련, LI, 실험 조건과 비교한 대조군의 LI 간의 차이(LI dif), LI dif의 95% 신뢰 구간의 하한(LL) 및 상한(UL)을 포함하는 출력 테이블(표 3)을 관찰하고, 그리고 유의미한 차이가 없을 확률을 나타내는 p-값입니다.
      참고: analearn은 데이터 파일이 있는 디렉토리에 출력 텍스트 파일을 저장합니다. 그러나 출력 테이블은 R-Studio 콘솔에도 나타납니다. 기본 이름은 제공된 데이터 파일의 이름을 기반으로 구성됩니다.
   5. analearn 함수에는 bootstrapping.
      참고: “nboot”는 부트스트랩 복제 수를 정의하며 기본적으로 10,000으로 설정됩니다. 이 값은 0보다 큰 정수로 변경할 수 있습니다. 표 5에는 함수의 기본 설정을 변경하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 인수가 포함되어 있습니다. 그러나 적은 수의 부트스트랩 반복실험으로 생성된 데이터는 사용하지 않는 것이 좋습니다.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–