초파리 굴을 파고 터널을 파는 분석: 파리 유충의 조직 저산소증을 평가하는 방법

초록

출처: Qiang, K. M., et al. 초파리 멜라노가스터 유충에서 저산소증 검출을 위한 굴착/터널링 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 초파리 유충의 굴 및 터널링 능력을 평가하여 저산소증을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하여 연구자들은 산소 결핍을 경험하는 유충과 발달 결핍이 있는 유충을 구별할 수 있습니다. 예시 프로토콜은 이 분석에 대한 설정을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌한 것입니다.

1. 유충의 준비

1. 분석을 시작하기 2일 이상 전에 Wieschaus 및 Nusslein-Volhard가 설명한 대로 50mL 폴리프로필렌 비커와 포도 한천을 포함하고 효모 페이스트를 바르고 사용 직전에 효모 페이스트를 바르는 6.0cm 일회용 페트리 접시를 사용하여 달걀 낳기 접시에 원하는 실험 및 대조군 조합(각각 최소 20명의 암컷과 10명의 수컷)의 십자가를 설정합니다. 파리는 달걀을 낳은 접시에 담아 필요할 때까지 실온의 어둠 속에서 보관하십시오.
2. 포도 한천 레시피 – 100L 유리 비커에 100mL 냉동 포도 주스 농축액, 350mL 탈이온수, 5mL 빙하 아세트산 및 13g D. melanogaster 한천을 결합합니다. 전자레인지는 한천이 모두 용해될 때까지 1-2분 동안 폭발 사이에 저어줍니다. 용액을 몇 분 동안 식힌 다음 95% 에탄올에 10%(메틸-p-하이드록시벤조에이트) 10mL를 첨가합니다. 일회용 6.0cm 페트리 접시에 플레이트당 7mL를 혼합한 다음 젤화하고 실온에서 3-4시간 동안 건조시킵니다. 비닐 봉지에 넣어 4 °C에서 보관하십시오.
3. 효모 페이스트 레시피 – 건조 효모 7g, 탈이온수 10mL를 주걱으로 균일한 농도가 될 때까지 섞습니다.
4. 실험적이고 통제 유충을 생성하기 위한 시간 제한 난자 수집. 효모가 묻은 새 포도 접시를 사용하여 아침 시간 동안 어둠 속에서 4시간 동안 실온에서 계란을 수집합니다. 이 4시간 수집 플레이트를 제거하고 새 플레이트로 교체하십시오. 대부분의 유충이 부화하는 다음날 오후까지 25 ° C에서 밤새 4 시간 수집 플레이트를 배양합니다. 이 첫 번째 instar 유충을 수집하여 실험을 설정하는 데 사용합니다.

2. 분석 플레이트 설정

1. 분석 플레이트의 준비. 분석을 한 번 실행하려면 실험용 유충 10마리와 대조군 유충 10마리로 구성된 플레이트 5개를 각각 5개의 분석 플레이트를 준비합니다. 1.5cm 코르크 천공을 사용하여 각 접시에서 한천의 중앙 코어를 제거하여 음식을 위한 구멍을 만듭니다. 이스트 페이스트(0.8 - 0.9g)를 구멍에 넣고 주걱으로 가볍게 두드려 구멍을 채우는 마운드를 만듭니다.
2. 한천 플레이트 준비 – 700L 유리 비커에 700mL의 탈이온수와 16g D. melanogaster 한천을 넣고 5분 동안 전자레인지에 넣습니다. 전자레인지에서 제거하고 유리 막대로 저어 용해되지 않은 한천을 용액에 넣습니다. 95% 에탄올에 10%(w/v) Nipagen 17.5mL를 넣고 혼합한 다음 모든 한천이 완전히 용해될 때까지 30초 동안 마이크로파 가열을 계속한 다음 교반합니다. 1-2분 동안 식힌 다음 15mL 분취액을 10cm 플라스틱 페트리 접시에 피펫으로 넣습니다. 한천을 겔화시키고 뚜껑으로 플레이트를 덮고 실온에서 몇 시간 또는 밤새 건조시킵니다. 밀봉된 비닐 봉지에 플레이트를 18°C.
   에서 보관하십시오. 참고 1: 과도한 건조로 인해 플레이트 표면에 Nipagen 결정이 형성되는 것을 방지하려면 준비 후 며칠 이내에 플레이트를 사용하십시오. 필요한 경우 95% 알코올 몇 마이크로리터를 떨어뜨려 결정을 다시 용해할 수 있습니다.
   참고 2 : 한천의 배치는 다른 겔화 특성을 가질 수 있습니다. 드라이 젤 플레이트는 만졌을 때 단단해야 하며 코르크 천공을 사용하여 음식 구멍을 만들 때 깨끗하고 손상되지 않은 한천을 제거할 수 있을 만큼 충분히 탄력적이어야 합니다(위 참조).
3. 분석 플레이트에 유충 설정. 기계적 압력을 사용하여 플라스틱 마이크로스패츌러의 끝을 구부리고 팁을 효모 페이스트에 담그면 유충을 집어들기 위한 "접착제"를 제공합니다. 첫 번째 instar 유충을 개별적으로 집어 먹이 더미에 가까운 한천 접시에 놓습니다. 실험 유전자형과 대조군 유전자형 모두에 대해 10마리의 유충으로 구성된 최소 5개의 복제 플레이트를 준비합니다. 완료되면 각 플레이트에 캡을 씌우고 라벨을 붙이고 플레이트를 실온(실험실에서는 22°C)의 어두운 공간에 놓습니다(뚜껑이 위를 향하게).

3. 분석 플레이트 모니터링

1. 해부 현미경으로 매일 플레이트를 검사하고 음식 위 또는 한천 표면에 있는 유충의 수를 기록하십시오. 눈에 보이는 죽거나 죽어가는 유충을 기록하십시오. 한천 하층으로 터널링하는 것이 유충이 세 번째 instar로 이동하는 것으로 보이는 경우와 경우에 유의하십시오. 번데기가 형성되기 시작하는 날짜를 기록하고 번데기 이상을 기록하십시오. 모든 유충이 죽거나 번데기가 될 때까지 매일 관찰을 계속하십시오.
2. 구부러진 놀리는 바늘로 접시에서 번데기를 조심스럽게 꺼내 포도 접시로 옮깁니다. 원하는 경우 번데기를 계속 모니터링하여 성충이 된 후 번데기가 몇 마리인지 확인하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
탈수 효모
냉동 포도 주스 농축액	웰치스(Welch's)		대부분의 대형 슈퍼마켓에서 구입할 수 있습니다
빙초산	시그마-알드리치	320099
초파리 한천	Apex Bioresearch 제품	66-103
메틸-파라-하이드록시벤조에이트	Apex Bioresearch 제품	20-658
설비
50ml 폴리프로필렌 비커
6.0cm 일회용 페트리 접시	송골매	08757100B
10cm 일회용 플라스틱 페트리 접시	E+K 사이언티픽	EK-24104
플라스틱 microspatulas	코닝 주식회사	3012
구부러진 놀리는 바늘	나스코	S08848MH
해부 현미경			10-30X 배율의 모든 현미경

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