제브라피시 심전도(ECG): 심장 기능을 평가하기 위한 최소 침습 분석

초록

출처: Zhao, Y., et al. 성체 제브라피시를 위한 생체 내 표면 심전도. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 제브라피시에서 심장의 전기적 활동을 측정하는 검사인 심전도(ECG 또는 EKG) 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish, J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2019).

이 연구의 모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 연구의 모든 동물 프로토콜은 UCLA 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 마취 유도

1. ECG 데이터 수집 중 모션 아티팩트를 피하기 위해 통증 조절 및 물고기 고정을 위한 침지 마취를 준비합니다. 대부분의 실험실에서는 이멀젼 트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트, MS-222)을 사용합니다.
   1. 트리카인 0.4% 원액을 만들려면 나사로 덮인 어두운 유리병에 트리카인 분말 400mg, 이중 증류수 98mL, 1M 트리스(pH 9) 2mL를 섞습니다. 필요에 따라 1N NaOH 또는 1N HCl을 사용하여 pH 7.0으로 조정합니다.
   2. 트리카인 최종 침지 용액을 만들려면 제브라피쉬의 나이, 크기, 대사 상태, 균주, 질병 모델, 과학적 목표 및 절차 기간에 적합한 최소 농도를 결정합니다.
   3. 트리카인 농도-반응 연구를 수행하여 필요한 경우 권장 농도인 168mg/L(또는 0.0168%)⁹에서 상향 또는 하향 적정하여 가능한 가장 적은 심폐 독성으로 3분 이내에 마취 수준 4에 도달합니다. 예를 들어, 이 연구에서 생후 12-18개월의 야생형 AB 제브라피시를 0.02-0.04% 트리카인 용액에 담그면 3분 이내에 마취 레벨 4가 유도됩니다.
      참고: 마취 레벨 4에서는 평형과 근육 긴장도가 완전히 손실되고 수술 속도가 감소합니다.
   4. 필요한 경우, 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 수의사와 상의하여 마취제 선택 및 투여 경로의 적절성에 대한 추가 지침을 받으십시오.
2. 성인 제브라피시를 미리 결정되고 IACUC가 승인한 가장 낮은 농도(예: 이 연구에서는 0.02-0.04%)의 트리카인 용액이 포함된 접시에 담그면 3분 이내에 마취 수준이 4가 됩니다(그림 1).
   1. 생존 ECG 프로토콜의 경우 ECG 기록 세션을 가능한 한 짧게(10분 미만) 유지합니다. 15분 미만으로 지속되는 짧은 ECG 기록 세션의 경우 마취 유지 관리가 필요하지 않습니다.
   2. 몇 시간 동안 지속되는 긴 ECG 기록 세션의 경우 지속성 근육 마비 및 구강 관류 시스템을 사용하여 충분한 수분 공급과 산소 공급을 제공하십시오.

2. ECG 리드 배치

1. 제브라피쉬가 3초 동안 마취 수준 4를 유지하면 한 쌍의 뭉툭한 집게를 사용하여 ECG 리드 전극을 배치하기 위해 복부 표면이 가장 위에 있는 축축한 스펀지 슬릿으로 물고기를 즉시 옮깁니다(그림 2).
2. 3개의 ECG 리드 전극을 물고기 근육 조직에 약 1mm 깊이로 부드럽게 삽입하여 심장 주축의 왼쪽 꼬리-오른쪽 두개골 방향과 평행한 전두면에 양극성 리드를 설정합니다.
3. 복부 정중선의 양극(빨간색) 전극을 구근 동맥 수준, 즉 수술부의 두 아래쪽 가장자리를 연결하는 가상선에서 1-2mm 위에 배치합니다(그림 2A).
4. 음극(검은색) 전극을 꼬리 방향으로 놓고 양극 측면으로 0.5-1.0mm 떨어진 곳에 성체 제브라피시 심실의 최대 apicobasal 길이보다 큰 거리에 배치합니다(그림 2A).
5. 기준(녹색) 전극을 항문 부위 근처의 꼬리 방향으로 배치합니다.
   참고: 심장 주축은 물고기마다 다소 다르기 때문에 R파와 T파의 진폭을 최대화하려면 시행착오를 통해 작고 체계적인 변화만 주어 리드 위치를 조정하십시오. 예를 들어, 한 번에 두 전극 대신 하나의 전극(양극 또는 음극)을 변경하고 임의의 방향으로 불규칙하게 변경하는 대신 다른 방향으로 변경하기 전에 지정된 한 방향으로 점진적으로 변경합니다.

3. 심전도 기록

1. ECG 데이터 수집 프로그램을 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 Range(범위), Low Pass(저역 통과) 및 High Pass(고역 통과)에 대한 원하는 설정을 선택합니다. 예를 들어, 이 실험에 사용된 생체 내 ECG 기록 시스템의 다음 설정은 정상적인 성인 제브라피쉬에 대해 일관되고 만족스러운 신호 대 잡음비를 생성합니다: 범위 "2mV", 저역 통과 "120Hz" 및 고역 통과 "0.03s").
2. Start를 눌러 1kHz의 샘플링 속도에서 연속 갭 없는 ECG 기록을 시작합니다.
3. 최대 신호 대 잡음비를 위해 리드 포지셔닝을 최적화하려면 중지를 눌러 ECG 기록을 중지하고 각 심장에 대한 첫 번째 기록 시도 직후 ECG 추적을 검토합니다. 성체 제브라피시 ECG가 정상인지 진단하려면 다음 네 가지 검증 기준이 모두 충족되는지 확인하십시오(그림 3).
   1. 기준 1: 모든 ECG 파형(P, QRS 및 T)이 뚜렷하고 쉽게 볼 수 있어야 합니다.
   2. 기준 2: P파가 양수인지 확인합니다.
   3. 기준 3: 순 QRS 복합파가 양수인지 확인합니다(즉, R파 진폭이 Q파와 S파 진폭의 합보다 큼).
   4. 기준 4: T파가 양수인지 확인합니다.
4. 정상 ECG가 예상되는 경우 필요한 경우 네 가지 검증 기준이 모두 충족될 때까지 전극을 재배치합니다(음극을 먼저 시도).
5. 정상적인 T파가 예상되지만 T파가 너무 작으면 전극의 위치를 변경하여 T파 진폭을 최대화합니다.
6. 리드 포지셔닝을 최적화한 후 ECG 기록을 재개합니다. 후속 분석을 위해 ECG 스윕을 저장합니다.

4. 마취 회복

1. ECG 기록 세션이 끝나면 물고기를 다치게 하지 않고 전극을 조심스럽게 제거하십시오. 생선을 트리카인이 없는 신선하고 산소가 공급된 생선 물로 옮깁니다.
2. 마취 후 회복을 촉진하려면 물고기가 규칙적인 아가미 움직임이나 수영을 재개할 때까지 파스퇴르 피펫으로 아가미 위로 물을 세게 분출합니다.
3. 물고기가 마취로부터 완전히 회복되었는지 모니터링하십시오(일반적으로 1-2분), 물고기가 최소 5초 동안 똑바로 수영할 수 있는 능력에서 알 수 있습니다.

결과

그림 1: 최소 침습적 생체 내 ECG 기록 프로토콜. 개략적인 순서도는 생체 내 ECG 조사를 수행할 때 4가지 중요한 작업 단계, 즉 마취 유도, ECG 리드 전극 배치, ECG 기록 및 ECG 기록 분석을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: ECG 리드 배치. 3개의 29게이지 색상으로 구분된 스테인리스 스틸 전극이 약 1mm 깊이까지 물고기 근육 조직에 단단히 삽입됩니다. 음극(검은색) 전극과 양극(빨간색) 전극을 배치하면 왼쪽 꼬리에서 오른쪽 두개골 방향...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
문화 요리	피셔 사이언티픽	FB087571	100mm x 20mm
Dumont 겸자	Fine Sciense 도구	11253-20	0.1 x 0.06 밀리미터
FE136 애니멀 바이오 앰프	AD 기기	FE231
홍채 겸자	Fine Sciense 도구	11064-07	0.6 x 0.5 밀리미터
랩차트 8 프로	AD 기기		ECG 모듈이 있는 소프트웨어
Animal Bio Amp용 바늘 전극	AD 기기	MLA1213	29 게이지
플라스틱 일회용 전사 피펫	피셔 사이언티픽	제13-669-12	6인치, 1.2mL
파워랩 4/35	AD 기기	4//35
트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)	시그마	E10521-10G	MS-222

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